Praca doktorska
Licencja
Dostęp zamkniętyBiałka AlkB – udział w naprawie DNA i modyfikacji tRNA
| dc.abstract.en | AlkB proteins remove cytotoxic alkyl groups at N1 position of purines and N3 position of pyrimidines from DNA and RNA by oxidative dealkylation. During the reaction catalyzed by AlkB dioxygenases alkyl groups at nucleobase are oxidized. This causes destabilization of bond between carbon of alkyl groups and nitrogen atom of nucleobase and leads to reconstitution of unmodified base and release of alkyl groups as appropriate aldehydes. The main lesions repaired by AlkBs are 1-meA and 3-meC, but they also repair other alkylation damages. First discovered protein that belongs to this family was AlkB protein from E. coli (EcAlkB), which is a part of the system of adaptive response to alkylating agents, Ada. In silico search revealed the existence of nine AlkB homologues in humans: 8 proteins called ABH1-8 and FTO (a protein associated with obesity). Function of these proteins still remains poorly understood, however it was proven that ABH1, ABH2, ABH3 and FTO have enzymatic activities against dealkylated nucleobases in DNA and/or RNA. But only for ABH2 these activities have been confirmed in vivo and ABH2 is considered a true repair enzyme. Recently, it was demonstrated that highly mutagenic ethenoadducts (1,N6-εA, 3,N4-εC) can be eliminated from DNA in a process of direct repair catalyzed by AlkB proteins. The aim of this study was to determine the repair activity of the bacterial AlkBs (belonging to the different groups created basing on amino acid sequence alignment of the nucleotide-recognition domain NRL) and human EcAlkB homologues: ABH2, ABH3, FTO against ethenoadducts in DNA. A new method of measuring AlkB activity against ethenoadducts was elaborated, and it was shown that bacterial AlkB proteins repair highly mutagenic ethenoadducts like 1,N6-εA, 3,N4-εC and 1,N2-εG. Therefore bacterial AlkB dioxygenases can constitute another repair mechanism, beside BER, involved in removing DNA ethenoadducts in vivo in bacteria. This study for the first time demonstrated that AlkB proteins display repair activity against 1,N2-εG. Moreover it was shown that proteins belonging to the same group, despite the high sequence similarity of amino acid sequence of the NRL domain, exhibit different activities against ethenoadducts in DNA. Human EcAlkB homologue, ABH2 was proved to repair in vitro 1,N6-εA and 3,N4-εC both in ss and ds DNA, but 1,N2-εG only in ds DNA. ABH3 protein can only poorly remove 3,N4-εC in ss DNA, whereas FTO doesn’t repair examinated ethenoadducts DNA at all. Recent studies revealed that AlkB proteins are also involved in the synthesis of uridine modification in tRNA. ABH8 protein is the only human homologue of the EcAlkB which contains – besides AlkB domain – also a methyltransferase domain, similar to the yeast tRNA methyltransferase Trm9 and RNA binding domain. This study has shown that ABH8 protein doesn’t repair lesions that are typical substrates for other AlkB proteins. However, full length ABH8 protein can methylate total RNA and tRNA, and the product of this methylation might be 5-methoxycarbonylmethyluridine (mcm5U), similar to the reaction catalysed by tRNA methyltransferase Trm9. In 2010 two research groups showed that methyltransferase domain of ABH8 indeed catalyzes methylation step resulting in the formation of mcm5U in tRNA and the AlkB domain hydroxylates mcm5U to (S)-5-methoxycarbonylhydroxymethyluridine ((S)-mchm5U). Due to this finding, further research on in vitro activity of ABH8, was interrupted. For this reason it was decided to examine whether the AlkB proteins showing high amino acid sequence similarity to AlkB domain of ABH8 are involved in the formation of tRNA modification or rather in repair of DNA/RNA. It has been demonstrated that two AlkB proteins from Cryptosporidium parvum Iowa II and Tetrahymena thermophila might be indeed involved in synthesis of uridine tRNA modification (they hydroxylation of mcm5U to (S)-mchm5U). However, the ability to introduce tRNA modification by remaining examinated AlkB proteins was not shown. |
| dc.abstract.pl | Białka AlkB usuwają cytotoksyczne grupy alkilowe w pozycjach N1-puryn i N3-pirymidyn w DNA i RNA w wyniku oksydacyjnej demetylacji. W reakcji katalizowanej przez dioksygenazy AlkB dołączona do zasady DNA grupa alkilowa jest utleniana, co destabilizuje wiązanie pomiędzy węglem grupy alkilowej a atomem azotu zasady i prowadzi do odtworzenia nieuszkodzonego nukleotydu i odłączenia grupy alkilowej w postaci odpowiedniego aldehydu. Głównymi uszkodzeniami naprawianymi przez białka AlkB są 1-meA i 3-meC, ale są one również w stanie naprawiać inne uszkodzenia alkilacyjne. Pierwszym odkrytym białkiem należącym do tej rodziny było białko AlkB E.coli (EcAlkB), wchodzące w skład systemu adaptacyjnej odpowiedzi na czynniki alkilujące Ada. U człowieka znaleziono dziewięć białek homologicznych do białka EcAlkB, a mianowicie: osiem białek określanych jako ABH1-8 oraz związane z otyłością białko FTO. Funkcje tych białek nie są do końca poznane. Dla ABH1, ABH2, ABH3 i FTO potwierdzono aktywność enzymatyczną wobec alkilacyjnie zmienionych zasad DNA i/lub RNA in vitro, jednak tylko w przypadku ABH2 potwierdzono taką aktywność również in vivo i białko to jest uważane za prawdziwy enzym naprawczy. Niedawno okazało się, że wysoce mutagenne etenoaddukty DNA (1,N6-εA, 3,N4-εC) mogą być usuwane także w procesie naprawy bezpośredniej, katalizowanej przez białka AlkB. Celem tej pracy było określenie aktywności naprawczej bakteryjnych białek AlkB (należących do różnych grup, wyodrębnionych na podstawie porównania sekwencji aminokwasowej domeny NRL odpowiedzialnej za wiązanie DNA/RNA) oraz ludzkich homologów EcAlkB, białek: ABH2, ABH3, FTO wobec etenoadduktów zasad DNA. Opracowano nową metodę badania naprawy etenoadduktów przez białka AlkB i wykazano, że bakteryjne białka AlkB są w stanie naprawiać etenoaddukty zasad DNA, takie jak 1,N6-εA, 3,N4-εC i 1,N2-εG. Zatem bakteryjne dioksygenazy AlkB mogą stanowić kolejny, obok szlaku BER, mechanizm naprawy etenoadduktów zasad DNA in vivo u bakterii. Po raz pierwszy, w tej pracy, wykazano aktywność naprawczą białek AlkB wobec 1,N2-εG. Wykazano również, że białka należące do tej samej grupy, mimo dużego podobieństwa sekwencji aminokwasowej regionu NRL, wykazują różną aktywność wobec etenoadduktów zasad DNA. W przypadku ludzkich homologów wykazano, że białko ABH2 in vitro naprawia 1,N6-εA oraz 3,N4-εC w ss i ds DNA, zaś 1,N2-εG jedynie w ds DNA. Białko ABH3 jest aktywne jedynie wobec 3,N4-εC w ss DNA, natomiast białko FTO nie naprawia żadnego z badanych etenoadduktów. Ostatnie badania pokazały, że białka AlkB są również zaangażowane w syntezę modyfikacji urydyny w tRNA. Białko ABH8 jako jedyny ludzki homolog oprócz domeny AlkB posiada również domenę metylotransferazy, wykazującą duże podobieństwo sekwencji aminokwasowej do drożdżowej metylotransferazy tRNA Trm9 oraz domenę wiążącą RNA. W niniejszej pracy wykazano, że ABH8 nie naprawia uszkodzeń będących typowymi substratami dla innych białek AlkB. Pokazano natomiast, że pełnej długości białko ABH8 posiada zdolność metylacji całkowitego RNA i tRNA, a produktem reakcji metylacji może być, podobnie jak w przypadku reakcji katalizowanej przez metylotransferazę Trm9, 5-metoksykarbonylometylourydyna (mcm5U). W roku 2010 dwie grupy badawcze wykazły, że domena metylotransferazowa ABH8 rzeczywiście katalizuje ostatni etap metylacji prowadzący do powstawania mcm5U w tRNA, natomiast domena AlkB jest odpowiedzialna za hydroksylację mcm5U do 5-(S)-metoksykarbonylohydroksymetylourydyny ((S)-mchm5U). Z tego powodu przerwano dalsze badania zmierzające do poznania aktywności białka ABH8 in vitro. Postanowiono natomiast zbadać, czy białka AlkB wykazujące podobieństwo sekwencji aminokwasowej do domeny AlkB białka ABH8 są zaangażowane we wprowadzanie modyfikacji tRNA, czy też w naprawę DNA/RNA. Wykazano, że dwa białka AlkB z Cryptosporidium parvum Iowa II i Tetrahymena thermophila (TT) mogą być zaangażowane we wprowadzanie modyfikacji urydyny w tRNA (hydroksylują mcm5U do (S)-mchm5U). Jednak nie udało się wykazać udziału pozostałych białek we wprowadzaniu badanych w tej pracy modyfikacji tRNA. |
| dc.affiliation.department | Wydział Biologii |
| dc.contributor.author | Zdżalik, Daria |
| dc.date.accessioned | 2013-11-04T11:42:36Z |
| dc.date.available | 2013-11-04T11:42:36Z |
| dc.date.defence | 2013-11-18 |
| dc.date.issued | 2013-11-04 |
| dc.description.additional | Link archiwalny https://depotuw.ceon.pl/handle/item/383 |
| dc.description.promoter | Tudek, Barbara |
| dc.identifier.uri | https://repozytorium.uw.edu.pl//handle/item/383 |
| dc.language.iso | pl |
| dc.rights | ClosedAccess |
| dc.subject.en | tRNA modifications |
| dc.subject.en | DNA repair |
| dc.subject.en | ethenoadducts |
| dc.subject.en | ABH (ALKBH) |
| dc.subject.en | AlkB |
| dc.subject.pl | modyfikacje tRNA |
| dc.subject.pl | naprawa DNA |
| dc.subject.pl | etenoaddukty |
| dc.subject.pl | ABH (ALKBH) |
| dc.subject.pl | AlkB |
| dc.title | Białka AlkB – udział w naprawie DNA i modyfikacji tRNA |
| dc.title.alternative | AlkB proteins –role in DNA repair and tRNA modification |
| dc.type | DoctoralThesis |
| dspace.entity.type | Publication |