Changes in oxidative metabolism of Arabidopsis thaliana in response to ammonium nutrition

Hodowla roślin na podłożu zawierającym jony amonowe (NH4+) jako jedyne źródło azotu powoduje zaburzenia wzrostu większości roślin, miedzy innymi rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana), określane jako „syndrom amonowy”. Żywienie amonowe może powodować zmiany w równowadze oksydoredukcyjnej prowadzące do zwiększonego wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS). Przedmiotem rozprawy doktorskiej była analiza zmian w metabolizmie oksydacyjnym rzodkiewnika podczas żywienia amonowego. Badania skupiały się na oznaczeniach zmian w wytwarzaniu i poziomie reaktywnych form tlenu, obronie antyoksydacyjnej oraz uszkodzeniach spowodowanych stresem oksydacyjnym. Szczególną uwagę poświęcono roli mitochondriów w utrzymaniu równowagi oksydoredukcyjnej. Długotrwała hodowla roślin, gdy jedynym źródłem azotu są jony amonowe, powoduje w liściach rzodkiewnika zwiększoną zwartość H2O2 i aktywuje systemy obrony antyoksydacyjnej. Stwierdzony, podwyższony poziom peroksydacji lipidów i białek utlenionych oraz aktywacja ekspresji genu UPOX (up-regulated by oxidative stress) wskazują na obecność stresu oksydacyjnego w tkankach rzodkiewnika. Może to stanowić jedną z przyczyn zahamowania wzrostu w odpowiedzi na żywienie amonowe. Zwiększone wytwarzanie ROS podczas żywienia amonowego zlokalizowano głównie na terenie mitochondriów. Wydaje się zatem, że podwyższone wytwarzanie ROS przez mitochondrialny łańcuch transportu elektronów (mtETC) może być źródłem stresu oksydacyjnego w liściach rzodkiewnika. Alternatywne szlaki mtETC, takie jak oksydaza alternatywna (AOX) oraz wewnętrzne i zewnętrzne dehydrogenazy typu II (NDin i NDex), mogą mieć znaczenie w obniżeniu wytwarzania ROS w mitochondriach roślin rosnących na pożywce z NH4+. Hodowla roślin transgenicznych Arabidopsis z wyciszoną ekspresją NDin (NDA1.2) oraz AOX1a (AS-12) na pożywce z NH4+ powodowała istotne zwiększenie stopnia utlenienie niskocząsteczkowych antyoksydantów. U roślin z nadekspresją AOX1a (XX-2) nie zaobserwowano tego efektu. Brak kompleksu I w łańcuchu oddechowym u mutanta frostbite1 (fro1) był kompensowany wzrostem ekspresji genów dehydrogenaz wewnętrznych i zewnętrznych, umożliwiając przeżycie roślin. Rośliny fro1 charakteryzowały sie niższą zawartością ROS w komórkach liści oraz silnie zahamowanym wzrostem, natomiast nie wykazywały syndromu amonowego. Wydaje się, że zmiany w apoplastowym metabolizmie ROS (niższa aktywność peroksydaz ścian komórkowych oraz obniżona zawartość dehydroaskorbinianu) mogą odpowiadać za szybszy wzrost roślin fro1 hodowanych na pożywce z jonami amonowymi w porównaniu do mutanta fro1 rosnącego na pożywce z jonami azotanowymi. Krótkotrwale żywienie amonowe (30 - 60 min) prowadziło do zmian w metabolizmie ROS u rzodkiewnika. Jednak szybka aktywacja obrony antyoksydacyjnej oraz indukcja alternatywnych szlaków mtETC stabilizowały poziom ROS i przeciwdziałały występowaniu stresu oksydacyjnego w liściach rzodkiewnika. Wykazano również, że rośliny dobrze aklimatyzowały się do zmiennej dostępności źródła azotu (NH4+ lub NO3-). Wydaje się zatem, że tylko długotrwała hodowla na pożywce zawierającej jony amonowe prowadzi do zachwiania homeostazy redoks, zwiększonego wytwarzania ROS i w konsekwencji do zahamowania wzrostu roślin.

Plants grown with ammonium (NH4+) as their sole nitrogen source experience growth inhibition—a condition known as ‘ammonium syndrome’, which affects most plant species, including Arabidopsis thaliana. Ammonium-based nutrition affects plant metabolism in a manner that leads to an intracellular redox imbalance. These changes in redox homeostasis can result in increased reactive oxygen species (ROS) production and trigger oxidative stress symptoms in plants. This study focused on oxidative stress determination in NH4⁺-grown Arabidopsis plants, as well as analysing ROS production, antioxidant defence, and oxidative damage. The aim of this thesis was to define the role of plant mitochondria in the oxidative metabolism of NH4⁺-fed plants. The long-term NH4+ nutrition of Arabidopsis leads to increased H2O2 content in leaves, induction of enzymatic antioxidant defence, and oxidation of low-mass antioxidants. Oxidative stress in NH4+-grown plants has been demonstrated to occur due to enhanced protein oxidation, lipid peroxidation, and the induced expression of UPOX (up-regulated by oxidative stress), a marker protein for oxidative stress. The oxidative stress symptoms observed in leaf tissues might be the cause of growth retardation in NH4+-grown Arabidopsis plants. Increased ROS production during NH4+ nutrition was primarily localized in mitochondria, and did not affect chloroplasts. Higher mitochondrial ROS production in response to NH4+ nutrition might induce oxidative stress in whole leaf tissues. Mitochondrial alternative pathways including alternative oxidase (AOX), and internal and external type II dehydrogenases (NDin and NDex), may play a significant role in lowering ROS production in NH4+-fed plants. Ammonium nourishment of transgenic Arabidopsis plants suppressing NDin (NDA1.2), and antisense mutants for AOX1a (AS-12) led to the increased oxidation of low-mass antioxidants, while the AOX1a overexpressor mutant (XX-2) was not affected. The absence of mitochondrial complex I in frostbite1 (fro1) was compensated by induced expression of NDex and NDin, which facilitated the survival of the mutant. Fro1 plants were characterised by lower intracellular ROS levels and restricted growth compared with wild-type plants, but did not exhibit ammonium syndrome. We proposed that changes to the apoplastic ROS metabolism of fro1, such as decreased cell wall peroxidase activity and lower dehydroascorbate content, may be responsible for the improved growth of fro1 during NH4+ nutrition in comparison to NO3--fed fro1. Short-term (30 – 60 min) NH4+ treatment triggered changes in ROS metabolism. However, the fast induction of antioxidant defences and mtETC alternative pathways lowered intracellular ROS levels, and protected the plant leaves from oxidative stress. Plants can acclimate to the changing of nitrogen sources from NH4+ to NO3-. Only the prolonged changes in redox homeostasis that occur during long-term NH4+ nutrition lead to ROS overproduction and growth retardation.