Characterization of intermolecular interactions of nucleobases and other nucleic acid components in small molecule crystals and in protein-RNA complexes with the use of the UBDB databank

Określenie struktury i energii oddziaływań jest niezbędne w projektowaniu leków, zrozumieniu mechanizmów procesów biologicznych oraz określeniu relacji struktura-funkcja w białkach. Dzięki metodom obliczeniowym możliwe jest oszacowanie energii oddziaływań elektrostatycznych wybranych kompleksów i wskazanie obszarów, których modyfikacje mogą zmieniać siłę oddziaływań. Energia elektrostatyczna ma największy udział w energii oddziaływań (szczególnie w układach biologicznych), dlatego jest najlepszym narzędziem do szacowania energii oddziaływań w biomakromolekułach. Pożądane są prostsze metody obliczeniowe niż obliczenia mechaniki kwantowej. W mojej pracy doktorskiej przedstawiam, w jaki sposób metoda zwana UBDB+EPMM (University at Buffalo Pseudoatom DataBank + Exact Potential Multipole Moments) może być stosowana do małych kryształów cząsteczek organicznych, ale także większych kompleksów białko-RNA. W pierwszej części mojej pracy skupiłam się na zasadach azotowych występujących w kwasach nukleinowych i ich analogach. Udało mi się uzyskać dobrej jakości kryształy chlorku izoguaniny i izocytozyny, dla których przeprowadziłem analizę strukturalną, którą wsparłam obliczeniami energii oddziaływań elektrostatycznych (Ees). W przypadku izoguaniny, bank UBDB został wykorzystany do rekonstrukcji gęstości ładunku, a dla izocytozyny stanowił punkt wyjścia do modelowania eksperymentalnej gęstości ładunku. W strukturze chlorku izoguaniny zaobserwowano dwa rodzaje taśm molekularnych, które zostały utworzone przez dimery kationów izoguaniny oddziałujących z anionami chlorkowymi. Analiza Ees wykazała, że kationy w jednym rodzaju taśmy były zorientowane tak, aby zminimalizować odpychające oddziaływania elektrostatyczne. Izocytozyna nie tworzyła sieci warstwowej. W krysztale izocytozyny występowały dwie formy tautomeryczne w jednej jednostce asymetrycznej połączone potrójnym wiązaniem wodorowym, a taki układ był bardzo korzystny energetycznie. Druga część mojego projektu miała na celu scharakteryzowanie oddziaływań elektrostatycznych w wybranych kompleksach białek IFIT z RNA. Na początku musiałam rozszerzyć UBDB o nowe typy atomów używane do opisu oddziaływań grupy trójfosforanowej RNA z białkami i jonami magnezu oraz zweryfikować funkcjonalność rozszerzonego banku. Następnie przeanalizowałam struktury białek IFIT1 i IFIT5, nałożyłam UBDB do rekonstrukcji rozkładu gęstości elektronowej i obliczyłam energie oddziaływań wybranych kompleksów białko-RNA. Na podstawie przeprowadzonych obliczeń byłam w stanie przeanalizować wpływ sekwencji białka lub RNA na energię oddziaływań w kompleksach IFIT-RNA. Obliczone energie oddziaływań porównałam ze stałymi dysocjacji kompleksów z literatury oraz z wynikami eksperymentów biofizycznych przeprowadzonych przeze mnie metodą termoforezy w mikroskali (MST). Wykazałam, że zgodnie z obliczeniami i wstępnymi wynikami eksperymentalnymi uzyskanymi metodą MST, białko IFIT1 powinno wiązać pppRNA z podobną siłą jak wiąże cap0RNA. Udowodniłam również, że zgodnie z obliczeniami energii elektrostatycznej, oddziaływania białka IFIT5 z RNA nie zależą od sekwencji pierwszych trzech nukleotydów RNA. Ponadto zidentyfikowałam ważne energetycznie aminokwasy, których mutacje mogą wpływać na siłę wiązania RNA przez białko. Moja praca pokazuje, że energia elektrostatyczna oddziaływań obliczona metodą UBDB+EPMM może wspierać eksperymenty, zarówno w fazie projektowania, jak i weryfikacji uzyskanych danych. Elektrostatyka ma moc predykcyjną, np. może wskazać silnie oddziałujące aminokwasy, których mutacja może mieć znaczący wpływ na siłę wiązania białko-ligand.

Determination of structure and interaction energy is essential in the area of drug design, understanding mechanisms of biological processes, and specifying structure-function relations in proteins. With computational methods, it is possible to estimate the electrostatic interaction energy of chosen complexes and indicate areas, whose modifications can alter interaction strength. Electrostatic energy has the most significant contribution to interaction energy (especially in biological systems) thus it is the best tool for estimating interaction energy in biomacromolecules. Simpler calculation methods than quantum mechanics calculations are desired. In my thesis, I present how the method called UBDB+EPMM (University at Buffalo Pseudoatom DataBank + Exact Potential Multipole Moments) can be used for small organic molecule crystals but also bigger protein-RNA complexes. In the first part of my work, I focused on nitrogenous bases found in nucleic acids (nucleobases) and their analogues. I managed to obtain good-quality crystals of isoguaninium chloride and isocytosine, for which I carried out a structural analysis that I supported with electrostatic interaction energy (Ees) calculations. In the case of isoguanine, the UBDB was used to reconstruct the charge density and for isocytosine, it was a starting point for modeling experimental charge density. In the structure of isoguaninium chloride, two kinds of molecular tapes were observed, which were formed by dimers of isoguaninium cations interacting with chloride anions. Ees analysis indicated that cations in one kind of tape were oriented to minimize repulsive electrostatic interactions. Isocytosine did not form a layered crystal structure. In the isocytosine crystal, there were two tautomeric forms in one asymmetric unit connected by a triple hydrogen bond, and such an arrangement was very favorable energetically. The second part of my project aimed to characterize electrostatic interactions in selected complexes of IFITs proteins with RNA. In the beginning, I needed to extend the UBDB with new atoms types used to describe interactions of the triphosphate group of RNA with proteins and magnesium ions and to validate the functionality of the extended databank. Next, I analyzed the structures of IFIT1 and IFIT5 proteins, transferred UBDB to reconstruct electron density distribution, and calculated interaction energies of selected protein-RNA complexes. Based on my calculations I was able to analyze the influence of protein or RNA sequence on interaction energy in IFIT-RNA complexes. Calculated interaction energies were compared with dissociation constants of complexes from literature and with experimental results of biophysics experiments conducted by me with the microscale thermophoresis (MST) method. I showed that, according to the calculations and preliminary experimental results obtained with the MST method, the IFIT1 protein should bind pppRNA with a similar strength as it binds cap0RNA. I also proved that, according to the calculations of electrostatic energy, the interactions of the IFIT5 protein with RNA do not depend on the sequence of the first three nucleotides of the RNA. In addition, I identified energy-important amino acids, the mutations of which may affect the strength of RNA binding by the protein. My thesis demonstrates that the electrostatic energy of interactions calculated with the UBDB+EPMM method can support experiments, either in the design phase or in the verification of the data obtained. Electrostatics has a predictive power, e.g. it can indicate strongly interacting amino acids, the mutation of which can have significant effects on the strength of protein-ligand binding.