Charakterystyka systemów replikacyjnych plazmidów pIGRK i pIGMS31 pochodzących ze szczepu Klebsiella pneumniae 287w

W niniejszej pracy dokonano kompleksowej analizy modułów replikacyjnych (REP) dwóch kryptycznych plazmidów, pIGRK i pIGMS31, wyizolowanych z klinicznego szczepu Klebsiella pneumoniae 287-w. Plazmidy te reprezentują nowo wyróżnioną rodzinę replikonów, (według danych literaturowych) replikujących się według modelu toczącego się koła (ang. rolling circle replication, RCR), której archetypem jest plazmid pHW126. Przeprowadzona analiza REP pIGRK i pIGMS31 obejmowała: identyfikację sekwencji nukleotydowych niezbędnych do inicjacji replikacji; identyfikację produktów białkowych genów rep oraz zbadania ich właściwości; charakterystykę mechanizmów regulacyjnych; określenie modelu replikacji badanych plazmidów. W celu identyfikacji sekwencji biorących udział w replikacji przygotowano pochodne plazmidów pIGRK i pIGMS31: (i) niosące kasetę oporności na kanamycynę (Kmr ) wbudowaną w różne miejsca genomów plazmidów, (ii) z delecjami wybranych elementów modułów REP, (iii) z mutacjami punktowymi wprowadzonymi drogą mutagenezy ukierunkowanej oraz (iv) pozbawione genów rep, lecz zdolne do replikacji w obecności wektora ekspresyjnego, dostarczającego produktów rep – układ reporterowy in trans. W wyniku przeprowadzonych badań określono minimalne replikony pIGRK i pIGMS31, składające się z: (i) origin replikacji zawierającego rejon konserwowany (CR) i cztery powtórzenia (iterony) (ii) oraz genu repR (pIGRK) lub repM (pIGMS31). Wykazano ponadto, że elementem istotnym dla właściwego funkcjonowania REP pIGRK i pIGMS31 jest sekwencja palindromowa położona powyżej minimalnego replikonu. Wykazuje ona znaczne podobieństwo do origin replikacji nici opóźnionej typu ssi (ang. single stand initiation), obecnego w genomach wielu plazmidów. Delecja ssi skutkowała powstawaniem form multimerycznych plazmidów i spadekiem ich stabilności. Geny rep pIGRK i pIGMS31 oraz ich zmutowane warianty sklonowano w wektorach ekspresyjnych, a powstałe zrekombinowane białka oczyszczono i zbadano ich zdolność do interakcji z DNA. Podczas analiz wykazano, że gen repR (pIGRK) koduje dwie formy białka: RepR oraz RepR’ (pozbawione 68 pierwszych aminokwasów, obecnych w RepR). RepR jest niezbędne do zainicjowania replikacji, a RepR’ pełni rolę negatywnego regulatora replikacji. Gen repM (pIGMS31) koduje tylko jedno białko inicjatorowe RepM. Wszystkie białka są zdolne do wiązania się z DNA. Za tę właściwość odpowiada zidentyfikowany in silico motyw wHTH (ang. winged helix-turn-helix) usytuowany w centralnej części RepR i RepM oraz Nkońcowej RepR’. RepR, RepR’ i RepM wiążą się in vitro z sekwencjami obecnymi w origin replikacji oraz z sekwencjami promotorów własnych genów. Białka te są zdolne do tworzenia form dimerycznych. Charakterystyka mechanizmów regulacyjnych kontrolujących funkcjonowanie modułów REP pIGRK i pIGMS31 obejmowała: (i) identyfikację promotorów obecnych w REP pIGRK i pIGMS31 oraz zbadanie wpływu białek Rep na aktywność tych promotorów, (ii) analizy Northern-blot w celu identyfikacji powstających tran skryptów oraz (iii) analizy RACE 5′ w celu wyznaczenia startów transkrypcji. W obrębie REP pIGRK i pIGMS31, oprócz promotora repR (PRK1) i repM (PMS1), zidentyfikowano kilka dodatkowych promotorów – PRK2 i PRK3 w pIGRK oraz PMS2, PMS3, PMS4, PMS5, PMS6 w pIGMS31. Dwa z nich, PRK3 i PMS3, położone w obrębie minimalnych replikonów, są niezbędne in cis do zainicjowania replikacji plazmidów. Wykazano, że PRK1 i PMS1 podlegają negatywnej regulacji przez białka RepR i RepR’ (PRK1) oraz RepM (PMS1). Zidentyfikowano w ich obrębie sekwencje operatorowe, działają także jako enhancery. Istotnym elementem pracy było zbadanie intermediatów DNA powstających podczas replikacji pIGRK i pIGMS31 (IRep), uwidocznionych w wyniku dwukierunkowej elektroforezy DNA w żelu agarozowym (2D-AGE). Co ciekawe, analizy 2D-AGE IRep pIGRK i pIGMS31 wykazały obecność sygnałów typowych dla replikacji typu theta. Wykazano również obecność IRep jednoniciowych (SS DNA), sugerujących również replikację według modelu RCR. Podsumowując, wykazano, że moduły REP badanych plazmidów mają unikatową strukturę. Mają one cechy typowe dla replikonów RCR i theta, co bardziej przypomina właściwości niektórych bakteriofagów i wirusów.

In this work, a comprehensive analysis of replication modules (REP) of pIGRK and pIGMS31 cryptic plasmids isolated from the clinical strain Klebsiella pneumoniae 287 was made. The plasmids represent a newly distinguished family whose archetype is plasmid pHW126. Based on the results of research on pHW126, this family was pre-classified into rolling circle replication (RCR) replicons. The analysis of the pIGRK and pIGMS31 REPs concerned: • identification of nucleotide sequences indispensable for replication; • identification of protein rep products and their properties; • characteristics of regulatory mechanisms; • determination of the replication model of the tested plasmids. To identify the sequences involved in replication, pIGRK and pIGMS31 derivatives were prepared carrying the kanamycin resistance cassette (Kmr ): (i) inserted at various sites in the plasmid genome, (ii) with deletions of selected sequence elements, (iii) with point mutations introduced by means of site-directed mutagenesis, (iv) with deletions of rep genes (capable of replication due to the presence of an expression vector providing rep products in trans). In pIGRK and pIGMS31 a minimal replicon was identified that consists of: (i) the replication origin: a sequence of ca. 200 bp containing a conserved region (CR) and four direct repeats (iterons) (ii) and the repR (pIGRK) or repM (pIGMS31) gene necessary in trans for replication. It has also been demonstrated that the essential element for the proper functioning of pIGRK and pIGMS31 REPs is the palindrome sequence located upstream of the minimal replicon. It shows a significant similarity to single stand initiation sequence (ssi) present in many plasmids and responsible for DNA lagging strand replication initiation. The ssi deletion caused plasmids to form multimeric forms and decreased their stability. In order to identify and analyze the properties of protein products of pIGRK and pIGMS31 rep genes these genes and their mutant variants were cloned in expression vectors. Overexpressed proteins with an attached histidine tag (6His) were purified and used for in vitro DNA-protein interaction analyses. The repR gene (pIGRK) has been shown to encode two forms of the protein: RepR and RepR’ (the latter lacking the first 68 amino acids present in RepR). RepR is necessary to initiate replication. The shorter protein, RepR’, acts as a negative replication regulator. The repM gene (pIGMS31) encodes only one RepM initiator protein. All proteins are able to bind to DNA. This property corresponds to the wHTH (winged helix-turn-helix) motif identified in silico that constitutes the central part of RepR and RepM and the N-terminal part of RepR’. RepR, RepR’ and RepM bind in vitro to the sequences present in the origin of replication and to the sequences of their own genes. Both Rep proteins encoded in pIGRK and Rep encoded in pIGRM31 are able to create dimeric forms. The conducted characterization of regulatory mechanisms controlling pIGRK and pIGMS31 REP modules included: (i) identification of promoters present in pIGRK and pIGMS31 REPs and examination of the Rep proteins’ influence on promoter activity (a test plasmid was used for this purpose with a promoterless version of the β-galactosidase reporter gene, ii) Northern-blot analysis to identify REP transcripts, (iii) RACE 5' analysis to determine transcriptional start sites. Within pIGRK and pIGMS31 REP modules, apart from the repR (PRK1) and repM (PMS1), promoters, additional promoters (PRK2 and PRK3 in pIGRK and PMS2, PMS3, PMS4, PMS5, PMS6 in pIGMS31) were identified. Two of them, PRK3 and PMS3, located within the determined minimal replicons, are necessary in cis for plasmids replication. Their removal abolished the replication of pIGRK and pIGMS31. It was shown that PRK1 and PMS1 are negatively regulated by RepR and RepR’ (PRK1) and RepM (PMS1) proteins. In addition bifunctional operator/enhancer sequences were identified within these promoters. An important element of the work was the examination of DNA replication intermediates (IRep) arising during the replication of pIGRK and pIGMS31. IReps were identified by two-dimentional DNA agarose gel electroforesis (2D-AGE). The 2D-AGE pIGRK and pIGMS31 IRep analysis showed the presence of signals typical for theta replication. The presence of an IRep in the form of single-stranded DNA (SS DNA) has also been demonstrated, suggesting that these plasmids may also replicate according to the RCR model. In summary, it was shown that the tested plasmids have a unique structure of REP modules. They have features typical for RCR and theta replicons. The mosaic structure of pIGRK and pIGMS31 replication systems is reflected in the unique course of replication of these plasmids (two models of replication) reserved so far for bacteriophages and viruses.