The role of DNA repair in cancer cells resistance to photodynamic therapy

Terapia fotodynamiczna (ang. photodynamic therapy, PDT) jest klinicznie zatwierdzoną metodą walki z nowotworami charakteryzującą się niską inwazyjnością oraz brakiem poważnych efektów ubocznych. Opiera się na wykorzystaniu substancji fotouczulającej oraz światła widzialnego do niszczenia komórek nowotworowych. Mechanizm jej działania polega na wzbudzeniu fotouczulacza przez światło, a następnie jego interakcji z tlenem znajdującym się w komórce, co w konsekwencji prowadzi do powstania reaktywnych form tego pierwiastka (RFT) i stresu oksydacyjnego, a następnie śmierci komórek. Niestety skuteczność terapii fotodynamicznej jest niższa od innych metod leczenia nowotworów – chemioterapii i radioterapii. Wiązać się to może ze zjawiskiem nabywania przez komórki nowotworowe oporności na PDT. W obronę komórkową przed cytotoksycznymi skutkami PDT zaangażowanych jest kilka mechanizmów, w tym aktywacja enzymów antyoksydacyjnych, pompy usuwające leki, degradacja substancji fotouczulającej i nadekspresja białek opiekuńczych. Jednak rola naprawy DNA w oporności komórek rakowych na PDT nie została dobrze poznana. Niniejszy projekt miał na celu uzyskanie wiedzy na temat roli naprawy DNA i innych potencjalnych nowych mechanizmów w nabywaniu oporności na terapię fotodynamiczną, jak również wykorzystanie tej wiedzy w poszukiwaniu nowych markerów oporności i nowych metod uwrażliwiania komórek nowotworowych na ten rodzaj leczenia. W tym celu wyizolowano komórki oporne na PDT z linii komórek glejaka (GBM, U-87 MG) i raka szyjki macicy (SKG-IIIa) poprzez wielokrotne powtarzanie cykli PDT i dalszą hodowlę przeżywających komórek. Uzyskane nowotworowe linie oporne (U-87 MGR i SKG-IIIaR) scharakteryzowano pod kątem poznania stopnia stresu oksydacyjnego i uszkodzeń DNA, proliferacji i przebiegu cyklu komórkowego, akumulacji protoporfiryny, znaczników epigenetycznych, ekspresji i aktywności enzymów naprawy DNA przez wycinanie zasad (ang. base excision repair, BER) oraz wydajności naprawy DNA. Ponadto zastosowano analizę mikromacierzy i proteomikę w celu zbadania nowych mechanizmów związanych z opornością na PDT. Wyniki wykazały, że oporność na PDT w linii komórkowej U-87 MGR może być konsekwencją kilku mechanizmów, które mogą funkcjonować niezależnie lub współdziałać przy nabywaniu przez komórki oporności na PDT. W komórkach U87 MGR wyższy poziom zmian epigenetycznych, w tym hipermetylacja DNA (5-mC i 5-hmC), pozytywna regulacja niekodujących RNA (rodzina SNORD) i deregulacja ekspresji niektórych miRNA oraz nadekspresja histonu H1F0 i HDAC10 mogą mieć silny wpływ na regulację ekspresji genów zaangażowanych w nabywanie oporności na PDT. Co ciekawe, niektóre z tych znaczników epigenetycznych powodują zmiany metabolizmu, przeprogramowanie cyklu komórkowego, spowolnienie proliferacji i różnicowania. Moje dane sugerują, że oporność na PDT w linii komórkowej glejaka może być związana ze zmniejszonym tempem metabolizmu, zmianą regulacji cyklu komórkowego (wydłużenie fazy G1) i wolniejszą proliferacją. Komórki U-87 MGR wykazywały niższe poziomy porfiryn, zarówno wewnątrzkomórkowych, jak i w pożywce, w tym PpIX (lek fotouczulający stosowany w PDT), co, pomimo braku bardziej efektywnie działających pomp komórkowych usuwających lek, jest najprawdopodobniej spowodowane zaburzeniem szlaku biosyntezy hemu. Zgodnie z oczekiwaniami zmiany epigenetyczne również rozregulowują ekspresję enzymów antyoksydacyjnych, prowadząc do mniejszego uszkodzenia oksydacyjnego DNA po PDT w komórkach opornych w porównaniu do wrażliwych. Oporność na PDT w komórkach glejaka może być również związana z wyższą wydajnością początkowych etapów szlaku BER i naprawą pęknięć DNA. Zwiększoną ekspresję i wyższą aktywację kinaz ATM i ATR, nadrzędnych cząsteczek sygnałowych odpowiedzi na uszkodzenie DNA (ang. DNA damage response, DDR), wykazano w komórkach opornych nawet przed traktowaniem PDT, co sugeruje, że są one dobrymi celami uwrażliwiania komórek na PDT. Zgodnie z oczekiwaniami, oporne komórki glejaka można częściowo uwrażliwić poprzez hamowanie kinazy ATM, która odgrywa kluczową rolę w oporności na PDT. Może to wynikać z roli ATM w zatrzymywaniu cyklu komórkowego w fazie G1, a tym samym ułatwianiu szybkiej odpowiedzi na uszkodzenie DNA wywołane przez PDT w komórkach opornych. Mechanizm oporności na PDT w komórkach raka szyjki macicy, chociaż łączy pewne cechy z glejakiem, różni się w ścieżce naprawy DNA. Przeprogramowanie cyklu komórkowego, wydłużenie fazy G1, wyższa aktywność zmiatania RFT i słabsza biosynteza PpIX są wspólnymi czynnikami w obu badanych liniach komórkowych opornych na PDT. Komórki raka szyjki macicy oporne na PDT wykazały silniejszą ekspresję niektórych białek BER, takich jak APE1 i PARP1 oraz zwiększoną aktywność głównych etapów BER w porównaniu z komórkami wrażliwymi. Dane te sugerowały, że komórki oporne mogą być uwrażliwione na PDT poprzez zahamowanie aktywności APE1 i PARP1. Okazało się, że oba enzymy są dobrym celem, z tym, że inhibitor APE1 był bardziej skuteczny. Odkrycia te wskazują na na kluczową rolę szlaku BER w nabywaniu oporności na PDT przez linię komórkową raka szyjki macicy, którą można pokonać przez hamowanie głównych enzymów tego szlaku naprawy DNA. Podsumowując, wyniki uzyskane podczas realizacji tego projektu wykazały, że oprócz innych ujawnionych mechanizmów naprawa DNA jest ważnym mechanizmem oporności na PDT zarówno w liniach komórkowych glejaka, jak i raka szyjki macicy. Badanie to sugeruje również, że inhibitor jednej z głównych knaz DDR, ATM i inhibitory szlaku BER (APE1 i PARP1) mogą stać się skutecznymi adiuwantami, które zwiększą skuteczność terapii fotodynamicznej, odpowiednio w GBM i raku szyjki macicy.

Photodynamic therapy (PDT) is a clinically approved and less invasive cancer treatment. It causes less damage to normal tissue compared to radiation or chemotherapy. The therapeutic procedure includes the application of a photosensitizing drug (PS) that is subsequently activated by monochromatic light of a specific wavelength. The photochemical reaction leads to the generation of highly toxic oxygen species (ROS) that induce oxidative stress in cells and ultimately promote cell death. The limitation of PDT is the development of resistance to PDT in some cancer cells. Several mechanisms are known to be involved in cellular defense against the cytotoxic effects of PDT, including the activation of antioxidant enzymes, drug efflux pumps, degradation of PS and overexpression of protein chaperons. However, the role of DNA repair in resistance of cancer cells to PDT has not been well studied. This project aimed to gain knowledge about the role of DNA repair and other potential novel mechanisms in acquiring resistance to photodynamic therapy, as well as to use this knowledge in the search for new resistance markers and new methods for sensitizing cancer cells to this type of treatment. For this purpose, PDT resistant cells were isolated from parental glioblastoma (GBM, U-87 MG) and cervical carcinoma (SKG-IIIa) cell lines following repetitive PDT cycles. Isolated resistant cells (U-87 MGR and SKG-IIIaR) were subjected to different approaches to characterize in terms of knowledge the degree of oxidative stress and DNA damage, cell cycle proliferation and course, protoporphyrin accumulation, epigenetic marks, expression and activity of DNA base excision repair (BER) enzymes and efficiency of DNA repair. Moreover, microarray and proteomics analysis was applied to explore novel mechanisms associated with the resistance to PDT in the glioblastoma cells. The results demonstrated that the resistance to PDT in U-87 MGR cell line may be a consequence of several mechanisms that can function independently or in collaboration. In U-87 MGR cells, a higher level of epigenetic changes, including DNA hypermethylation (5-mC and 5-hmC), upregulation of noncoding RNAs (SNORD family) and deregulation of some miRNAs expression, upregulation of histone H1F0 and overexpression of HDAC10 can cause striking effects in the regulation of gene expression engaged in the acquiring of resistance to PDT. Interestingly, some of these epigenetic marks are known to cause metabolic changes, cell cycle reprogramming, slower proliferation, and differentiation. Here, my data suggests that resistance to PDT in the glioblastoma cell line may be associated with reduced rate of some metabolic pathways, change in cell cycle regulation (the G1 phase elongation) and slower proliferation. U-87 MGR cells exhibited lower levels of porphyrins, both intracellular and in medium, including PpIX (PS for PDT), which, despite upregulation of drug efflux pumps, is most likely due to an impairment of the heme biosynthesis pathway. As expected, epigenetic changes also deregulate the expression of antioxidant enzymes, leading to lower oxidative DNA damage after PDT in the resistant cells than in the parental sensitive ones. Resistance to PDT in glioblastoma cells may also be associated with higher efficiency of the initial steps of the BER pathway and the repair of DNA breaks. Increased expression and higher activation of ATM and ATR kinases, main and primary signaling molecules of DNA damage response (DDR), were demonstrated in resistant U-87 MGR cells even before PDT treatment, suggesting that they are good targets for sensitization of resistant cells to PDT. As expected, resistant glioblastoma cells can be partially sensitized to PDT by inhibiting ATM kinase, which suggests that ATM has a crucial role in PDT resistance. This may be due to the role of ATM in extending the G1 phase (inducing the G1 checkpoint), and thus facilitating the rapid response to PDTmediated DNA damage in U-87 MG resistant cells. PDT resistant cervical carcinoma cell line, although shared some common features with glioblastoma resistant cells, differed in DNA repair. The cell cycle reprogramming, the G1 checkpoint, higher ROS scavenging activity and lower PpIX biosynthesis rate were common factors in both U-87 MGR and SKG-IIIaR cell lines. Compared to their parental line, PDT resistant SKG-IIIa cells overexpressed two important proteins involved in BER, APE1 and PARP1, and demonstrated increased activity of the major BER steps. This indicated that resistant cells could be sensitized to PDT by inhibiting the APE1 and PARP1 activity. Indeed both enzymes proved to be the target; however, the APE1inhibitor was more effective. These findings indicate a key role of the BER pathway in acquiring resistance to PDT in the cervical carcinoma cell line, which can be overcome by inhibiting two BER enzymes. In summary, data obtained during this project showed that, besides other mechanisms disclosed, DNA repair is the important mechanism of PDT resistance in both glioblastoma and cervical carcinoma cell lines. This study also suggests that the inhibitor of one of the major DDR kinase, ATM and inhibitors of the BER pathway (APE1 and PARP1) may become effective adjuvants that increase the effectiveness of PDT therapy in GBM and cervical cancer, respectively.