Dynamic changes of the photosynthetic apparatus from an extremophilic red alga Cyanidioschyzon merolae in variable light conditions

Jednym z największych wyzwań w biologii jest zrozumienie mechanizmów molekularnych, które określają granice życia w ekstremalnych warunkach. Poznanie mechanizmów molekularnych, które rządzą adaptacją ekstremofili do tak trudnych warunków zewnętrznych, jest ważne dla zrozumienia, jak życie mogło ewoluować i przetrwać we wczesnej historii naszej planety. To fascynujące zagadnienie było przedmiotem obecnego projektu doktoranckiego, którego celem było dogłębne scharakteryzowanie molekularnych mechanizmów długotrwałej fotoadaptacji modelowego organizmu, termokwasolubnego krasnorostu Cyanidioschyzon merolae (C. merolae). Ten jednokomórkowy glon zyskał w ostatnich latach duże zainteresowanie, ze względu na jego wyjątkowe położenie ewolucyjne w pobliżu korzenia linii krasnorostów, które tworzą podstawową grupę w obrębie eukariontów, a które wyodrębniły się około 1,3 miliarda lat temu w ramach najstarszego rzędu glonów Cyanidiales. Uważa się, że gatunek ten jest ogniwem ewolucyjnym pomiędzy aparatem fotosyntetycznym prokariotycznych sinic, a jego odpowiednikiem z eukariotycznych fototrofów zielonej linii ewolucyjnej. Interdyscyplinarne i wieloaspektowe badania opisane w obecnej pracy zidentyfikowały kilka molekularnych mechanizmów długotrwałej fotoadaptacji w komórkach C. merolae wystawionych na działanie różnych reżimów świetlnych, które leżą u podstaw obserwowanej wysokiej stabilności i aktywności fotochemicznej aparatu fotosyntetycznego tej ekstremofilnej mikroalgi pomimo trudnych warunków środowiskowych stanowiących jej naturalne środowisko. Niniejsze badania wykazały akumulację fotoprotekcyjnego karotenoidu zeaksantyny (Zea), zarówno w kompleksach antenowych, jak i w kompleksach rdzeniowych superkompleksu PSI-LHCI w warunkach ekstremalnie wysokiego natężenia światła (eHL), służącego jako wygaszacz destrukcyjnych stanów trypletowych chlorofilu (Chl) (3Chl*). Analizy absorpcji i fluorescencji w 77K całych komórek pokazały znaczącą przebudowę wielkości funkcjonalnych anten PSII i PSI podczas przedłużonej adaptacji komórek C. merolae do warunków niskiego oświetlenia (LL ), eHL, światła czerwonego (RL) i dalekiej czerwieni (FRL). Większa akumulacja białek fikoblisomalnych (PBS) podczas adaptacji komórek do LL w porównaniu do warunków ML została wykryta poprzez pomiary spektroskopowe; jednakże tendencja ta nie utrzymała się w warunkach RL i FRL. Może to wynikać z faktu, że rzeczywiste zmiany stechiometrii PSII/PSI, również zaobserwowane w obecnej rozprawie, mogą sprzyjać akumulacji PSII w warunkach RL i FRL w komórkach C. merolae (podobnie jak w warunkach eHL) jako sposób na utrzymanie maksymalnej wydajności kwantowej PSII, jak również zrównoważonego transportu elektronów pomiędzy PSII i PSI w warunkach ograniczonego dostępu światła. Na poziomie kompleksu PSI-LHCI zidentyfikowano zmiany w stechiometrii dwóch izomerów tego kompleksu izolowanych z różnych warunków świetlnych, co jest zgodne z ostatnimi doniesieniami strukturalnymi. Jednocześnie analiza proteomiczna tych samych kompleksów pokazała dysocjację podjednostki rdzeniowej PsaK znajdującej się na granicy kompleksu rdzeniowego i antenowego. W niniejszej rozprawie udowodniono imponującą plastyczność i stabilność kompleksu PSI-LHCI z C. merolae w szerokim zakresie warunków stresowych, w tym w warunkach wysokiego oświetlenia, ekstremalnego pH i wysokiej temperatury. Pokazano, iż podjednostki antenowe Lhcr są trwale związane z kompleksem rdzeniowym PSI, nawet w przypadku naprężeń mechanicznych, które powodują odwracalne funkcjonalne rozłączenie obu składników bez ich fizycznej dysocjacji. Badania za pomocą spektroskopii czasowo-rozdzielczej pozwoliły na określenie kinetyki wczesnych procesów konwersji energii słonecznej poprzez opracowanie wysokiej rozdzielczości modeli kinetycznych transferu energii w superkompleksach PSI-LHCI z C. merolae izolowanych z różnych reżimów świetlnych. W szczególności, określono podwójną rolę funkcjonalną tzw. czerwonych chlorofili, tj. jako pułapek energii lub pigmentów antenowych w zależności od warunków oświetlenia komórek. Na poziomie całego aparatu fotosyntetycznego, zaobserwowano zmiany stechiometrii PSII/PSI in vivo poprzez pomiary widm emisyjnych fluorescencji w 77K komórek C. merolae zaadaptowanych do zmiennej ilości światła (LL; średnie światło, ML i eHL) i różnej jakości spektralnej (RL, FRL). Pokazano, że w warunkach LL C. merolae zwiększa ilość anten PBS funkcjonalnie związanych z PSII jako mechanizm kompensujący ograniczoną ilość światła absorbowanego przez RC PSII w porównaniu z warunkami ML. Mechanizm ten był nieobecny w warunkach RL i FRL, co sugeruje, że stechiometria PSII/PSI może odgrywać główną rolę w kontroli optymalnej kinetyki przepływu elektronów w warunkach ograniczonego oświetlenia. Zaproponowano, że zidentyfikowane w obecnej rozprawie specyficzne izoformy PSI-LHCI mogą przyczynić się do precyzyjnego dostrojenia kinetyki fotosyntetycznego przepływu elektronów, zarówno cyklicznego, jak i liniowego, optymalizując tym samym wydajność fotosyntezy w warunkach ograniczonego oświetlenia. W niniejszej rozprawie po raz pierwszy pokazano utworzenie i rearanżację strukturalną mikrodomen (MD) tylakoidowych bogatych w kompleksy fotosyntetyczne PBS-PSII i PSI- LHCI podczas długotrwałej adaptacji komórek C. merolae do zmiennego natężenia światła. Zaobserwowano niejednorodne rozmieszczenie MD z PBS-PSII w tylakoidach C. merolae w zależności od reżimu oświetlenia. Z kolei rozmieszczenie kompleksu PSI-LHCI jest równomierne w tylakoidach w porównaniu z dystrybucją superkompleksu PSII-PBS, aczkolwiek w większej ilości na granicy MDs z PBS-PSII. Heterogeniczna dystrybucja PSI- LHCI została zniesiona w tylakoidach w eHL, gdzie wszystkie kompleksy fotosyntetyczne były równomiernie rozmieszczone na skutek wymieszania się MDs bogatych w PSI-LHCI z MDs z PBS-PSII. Postuluje się, że owa zmiana redystrybucji kompleksów PSI-LHCI w czasie długotrwałej adaptacji komórek C. merolae do eHL niweluje stres ekscytoniczny na kompleks PSII poprzez: (1), uruchomienie mechanizmu fotosyntetycznego przejścia stanu 2 do stanu 1 (ang. State 2-State 1 transition) oraz (2), aktywację procesu niefotochemicznego wygaszania energii wzbudzenia (NPQ) i/lub przepływu energii wzbudzenia z PSII do PSI poprzez PBS (tzw. spill-over). Opisane powyżej zmiany strukturalne zaobserwowane na poziomie MDs pozwalają na optymalizację przepływu elektronów w aparacie fotosyntetycznym w komórkach C. merolae w czasie adaptacji do zmiennych warunków oświetlenia. Niniejsza rozprawa zidentyfikowała ważny molekularny mechanizm długoterminowej adaptacji aparatu fotosyntetycznego C. merolae oparty na modulacji fotoprotekcyjnego procesu NPQ dla optymalnego wykorzystania zaabsorbowanego światła. Zidentyfikowano dwa odrębne mechanizmy NPQ: w warunkach eHL oraz w warunkach LL/ML: (1) dominujący typowy NPQ indukowany bodźcem świetlnym, głównie w komórkach przystosowanych do LL i ML, oraz (2) kompensacja indukowanego bodźcem świetlnym NPQ poprzez aktywację przejścia stanów (ST) potwierdzoną zaobserwowaniem krótkotrwałego wzrostu fluorescencji w niskim świetle niebieskim w komórkach eHL. Dane te sugerują, że mechanizm ST lub inna forma regulacji redystrybucji energii wzbudzenia pomiędzy fotosystemami jest funkcjonalnie ważniejsza w komórkach przystosowanych do eHL. Tak więc, komórki LL i ML wykazują typową odpowiedź NPQ, tj. wygaszanie fluorescencji PSII w niebieskim świetle o wysokiej intensywności i brak indukowanego przez ST wzrostu fluorescencji po oświetleniu niebieskim światłem o niskiej intensywności. W przeciwieństwie do tego, w komórkach eHL komponent ST wygaszania MT jest ważny dla efektywnej długotrwałej fotoadaptacji, co może mieć związek z obserwowaną w tym badaniu przestrzenną redystrybucją PSI w tylakoidach eHL i LL. Postuluje się, że kompleks PSI-LHCI może odgrywać rolę fotoprotekcyjną w szybkiej fazie wygaszania, prawdopodobnie poprzez zaabsorbowanie nadmiernej energii wzbudzenia z PSII. Hipotezę tę potwierdza znacznie zaobserwowana w obecnej rozprawie szybsza kinetyka wygaszania w komórkach eHL w porównaniu tym procesem w komórkach LL i ML. Niniejsza rozprawa zawiera pierwszy kompleksowy opis transkryptomu komórek C. merolae poddanych długoterminowej fotoadaptacji w celu określenia wpływu zmiennej jakości i ilości oświetlenia aparatu fotosyntetycznego w tych komórkach na równowagę pomiędzy absorpcją energii słonecznej i jej fotochemicznym wykorzystywaniem a procesami katabolicznymi: centralnym metabolizmem węgla i azotu, jak również procesami podziału komórkowego. Regulacja transkryptomiczną fotosyntezy i jej molekularnych regulacyjnych komponentów została potwierdzona równolegle z transkryptomiczną regulacją szlaków metabolicznych związanych z detoksykacją reaktywnych form tlenu, podziałem komórkowym oraz centralnym metabolizmem węgla i azotu. Taka skomplikowana sieć wzajemnych oddziaływań pomiędzy procesami fotosyntetycznymi a innymi kluczowymi szlakami metabolicznymi stanowi podstawę do utrzymania najwyższej wydajności fotosyntezy w warunkach ograniczonego dostępu światła w komórkach C. merolae. Podsumowując, precyzyjne określenie mechanizmów molekularnych regulujących fotoprotekcję, fotoadaptację i wysoką stabilność aparatu fotosyntetycznego z ekstremofilnego krasnorostu C. merolae umożliwiło dogłębny wgląd w procesy wydajnej konwersji energii słonecznej i utrzymania homeostazy energetycznej komórek tego glonu w ekstremalnych warunkach środowiskowych. Fundamentalne odkrycia opisane w obecnej rozprawie posiadają duży potencjał translacyjny. Zdobyta wiedza dzięki tym odkryciom umożliwia bowiem mechanistyczny wgląd w wydajny, indukowany przez światło transfer elektronów w ekstremofilnym aparacie fotosyntetycznym o wysokiej stabilności, co ma ogromne znaczenie w praktycznym zastosowaniu kluczowych molekularnych komponentów tego układu w technologiach konwersji energii słonecznej w zieloną elektryczność i paliwo.

One of the biggest challenges in biology is to understand the molecular mechanisms that define limits of life under extreme conditions. Dissecting the molecular mechanisms that govern the adaptation of extremophiles to such challenging external conditions is important for understanding how life may have evolved and survived in the early history of our planet. This fascinating topic was the subject of this PhD study providing the in-depth characterisation of the long-term photoadaptation molecular mechanisms of a model organism, red thermo- acidophilic microalga Cyanidioschyzon merolae (C. merolae). This unicellular alga has gained a considerable interest in recent years, due to its unique evolutionary positioning near the root of the red algal lineage that forms a basal group within the eukaryotes and diverged circa 1.3 billion years ago within the most ancient algal order of Cyanidiales. It constitutes an evolutionary link between the photosynthetic apparatus of prokaryotic cyanobacteria and that of the eukaryotic phototrophs of the green lineage. The interdisciplinary and multifaceted studies described in this thesis have identified several molecular mechanisms of a long-term photoadaptation in C. merolae cells exposed to various light regimes that underlie the observed high stability and photochemical activity of the photosynthetic apparatus of this extremophilic microalga despite the harsh environmental conditions constituting its natural habitat. This study shows accumulation of the photoprotective carotenoid zeaxanthin (Zea) in both the antenna complexes and the core complexes of the PSI-LHCI supercomplex under extreme high light (eHL) intensity, serving as a quencher of chlorophyll (Chl) triplet states (3Chl*). Absorption and 77K fluorescence analyses of the whole cells highlighted the significant remodelling of the antenna size of PSII and PSI during prolonged adaptation of C. merolae cells to low light (LL), eHL, red light (RL) and far- red light (FRL) conditions. The higher accumulation of PBS proteins was detected in LL compared to ML conditions; however, this trend was not sustained in RL or FRL conditions. This may be due to the fact that the actual PSII/PSI stoichiometry changes, also observed in this study, may favour PSII accumulation under RL and FRL conditions in C. merolae cells (similarly to eHL conditions) as a means to sustain high maximum quantum yield of PSII and balanced electron transport between PSII and PSI under light limiting conditions. At the level of PSI-LHCI complex, changes in the stoichiometry of two PSI-LHCI isomers obtained from different light conditions were identified in line with the recent structural reports. The PSI-LHCI subunit remodelling occurred as determined by proteomic analysis showing the dissociation of the PsaK core subunit located at the boundary of the core and antenna complexes in the PSI-LHCI structure. In this thesis, the impressive functional plasticity and stability of the PSI-LHCI complex from C. merolae are demonstrated across a wide range of stress conditions, including high light, extreme pH and high temperature. Moreover, the Lhcr antenna subunits are permanently bound to the PSI core complex, even under mechanical stress that exerts reversible functional dissociation of the LHCI antenna from the RC without their physical dissociation. The determination of the kinetics of early solar energy conversion processes was achieved by developing high-resolution kinetic models of energy transfer within C. merolae PSI-LHCI supercomplexes isolated from various light regimes. In particular, the dual functional role of the so-called red Chls, i.e., as the energy traps or the light harvesting molecules was determined. At the level of the whole photosynthetic apparatus, changes of the PSII/PSI stoichiometry were observed in vivo by measuring the 77K fluorescence emission and excitation spectra of the C. merolae cells adapted to varying light quantity (LL; medium light, ML; and eHL) and quality (RL, FRL). It was determined that in LL conditions C. merolae increases the amount of PBS antenna functionally associated with PSII as the mechanism to compensate for the limited amount of light absorbed by PSII RC compared to ML conditions. This mechanism was absent in both RL and FRL conditions, which suggests that the PSII/PSI ratio may play the main role in controlling the optimal rate of electron flow under these light-limiting conditions. It is possible that the specific PSI-LHCI isoforms identified in this thesis may contribute to fine- tuning of the photosynthetic electron flow, both cyclic and linear, optimising the photosynthetic efficiency under light limiting conditions. This work has demonstrated for the first time the formation and rearrangement of the PBS- PSII and PSI-rich microdomains (MDs) upon long-term adaptation of C. merolae thylakoids to varying light intensity. The heterogeneous MD distribution was clearly visible in thylakoids of C. merolae based on the PSII-PBS fluorescence signal. Conversely, PSI-LHCI complex was shown in this study to be uniformly distributed throughout thylakoids compared to PSII-PBS, albeit more abundantly at the border of the MD domains. The heterogeneity of PSI-LHCI complex distribution was abolished in eHL thylakoids, whereby all photosynthetic complexes were uniformly distributed due to intermixing of PSI-LHCI with PSII-rich MDs. Such redistribution of PSI-LHCI in long-term eHL adaptation may alleviate excitonic pressure on PSII by: (1) triggering State 2-to-State 1 transition and (2), increasing the overall non- photochemical quenching (NPQ) response and/or PBS-PSII-PSI energy spill-over. The above- described structural changes at the level of thylakoid MDs allow for the optimization of photosynthetic electron flow under varying light conditions. This work identified an important mechanism of a long-term adaptation of C. merolae photosynthetic apparatus based on the modulation of the NPQ photoprotective response as the means for optimal light utilisation. Two distinct NPQ mechanisms in eHL versus LL/ML conditions were dissected: (1) the dominant typical flash-induced NPQ mostly in LL- and ML- adapted cells, and (2), the multiple turnover (MT) flash-induced quenching that is compensated by state transition (ST)-induced increase in fluorescence in low blue light in eHL cells. These data imply that the ST mechanism or regulation of excitation redistribution between photosystems is functionally more important in eHL-adapted cells. Thus, the LL- and ML- adapted red algal cells exhibit a typical NPQ response, i.e., PSII fluorescence quenching in high-intensity blue light, and no involvement of the ST induced fluorescence increase upon low blue light illumination. In contrast, in eHL cells, the ST component of MT quenching is important for efficient long-term photoadaptation, which could relate to the spatial redistribution of PSI in eHL and LL thylakoids observed in this study. Subsequently, PSI may play a role in the rapid phase of the quenching, likely via excitation energy spill-over from overexcited PSII onto PSI that is likely to be primed for quenching. This hypothesis is supported by the much faster quenching kinetics in eHL cells compared to LL and ML counterparts also observed in this study. This PhD thesis provided the first comprehensive transcriptomic analysis of the mechanisms of long-term photoadaptation of C. merolae cells in order to assess the influence of varying light quality and quantity on the balance between solar energy capture and utilisation in photosynthesis and the downstream processes of central carbon and nitrogen metabolism, as well as cellular growth and division. The transcriptional regulation of photosynthesis and its regulatory components was observed concomitantly with the transcriptomic regulation of the downstream metabolic pathways related to reactive oxygen species detoxification, cell/organelle division, and central carbon and nitrogen metabolism. Such an intricate network of interplay between light-driven reactions and downstream metabolic pathways provides the necessary basis for maintaining the highest photosynthetic performance under light-limiting conditions. In summary, the precise determination of molecular mechanisms regulating photoprotection and high stability of the photosynthetic apparatus of the extremophilic unicellular alga C. merolae has provided an in-depth insight into the molecular mechanisms of efficient solar energy conversion and maintenance of cellular energy homeostasis under extreme environmental conditions. The knowledge gained in this PhD project has great translational potential. This is because it provides mechanistic insights into the efficient photo-induced electron transfer in the robust photosynthetic apparatus that is of great interest in green solar conversion technology applications.