Molekularna identyfikacja autotroficznych euglenin

Celem pracy było wyznaczenie fragmentu DNA, który byłby odpowiednim kodem kreskowym DNA do identyfikacji autotroficznych euglenin, a także przetestowanie jego działania oraz stworzenie bazy sekwencji referencyjnych. Pod uwagę brano fragment genu COI oraz dziesięć fragmentów 18S rDNA zawierających każdy z rejonów hiperzmiennych V1 - V9 oraz oba rejony V2 i V3. Utworzono bazę 593 sekwencji referencyjnych 18S rDNA reprezentujących 156 gatunków należących do 14 rodzajów autotroficznych euglenin. W skład bazy weszły 474 sekwencje pochodzące z bazy danych GenBank, których przyporządkowanie do gatunku zostało zweryfikowane na podstawie danych literaturowych oraz analiz filogenetycznych i morfologicznych oraz 119 sekwencji 46 gatunków uzyskanych w ramach niniejszej pracy (głównie z izolatów z prób środowiskowych). Wśród nich znalazły się trzy gatunki nowe dla nauki (Phacus cristatus, Phacus crassus i Euglenaria clepsydroides). Uzyskano także 42 sekwencje genu COI.Podczas oceny przydatności markerów DNA jako kodów kreskowych wzięto pod uwagę zarówno łatwość amplifikacji i uniwersalność markera, jak też skuteczność w identyfikacji gatunków określaną na podstawie obecności przerwy w zakresach zmienności międzygatunkowej i wewnątrzgatunkowej (ang. „barcoding gap”), a także liczbowych wskaźników prawdopodobieństwa poprawnej identyfikacji (ang. Probability of Correct Identification, PCI). Analizę genu COI przeprowadzono używając zestawu 43 sekwencji reprezentujących 24 gatunki i odrzucono jako nieodpowiedni na kod kreskowy z powodu niemożliwości zaprojektowania uniwersalnych starterów dla euglenin. Do porównania fragmentów 18S rDNA użyto utworzonej bazy sekwencji referencyjnych (593 sekwencji). Za najlepsze kody kreskowe DNA dla euglenin uznano fragmenty V2, V2-3, V4 i V8 18S rDNA na podstawie wysokiej skuteczności identyfikacji gatunków oraz rodzajów (odpowiednio powyżej 95% i 97%) a także odpowiedniej długości (średnio do około 500 p.z. w przypadku V2-3 i V4 oraz 200 p.z. przypadku V2 i V8). Zaprojektowano także startery, umożliwiające wydajną amplifikację metodą PCR czterech wybranych fragmentów oraz potwierdzono skuteczność identyfikacji gatunków za ich pomocą zarówno w testach in silico (na podstawie posiadanej bazy danych sekwencji) jak i laboratoryjnych (identyfikacji gatunków w mieszaninach szczepów laboratoryjnych).

The aim of the study was to establish a DNA barcode for molecular identification of autotrophic euglenids, to test the performance of the chosen marker and to create the reference database for it. We considered the COI gene and ten fragments of 18S rDNA (nine containing all hipervariable V1 – V9 regions and the tenth containing both V2 and V3 regions).We created a database consisting of 593 18S rDNA sequences of 156 species belonging to 14 genera of autotrophic euglenids. It contained 474 sequences from GenBank, in which species assignment is verified based on literature, phylogenetic position and morphology. The remaining 119 sequences of 46 species were obtained in this study, mainly from environmental samples. Among them there were three species new to science (Phacus cristatus, Phacus crassus and Euglenaria clepsydroides). 42 COI sequences were also obtained. To validate molecular markers as DNA barcodes we considered the universality and the easiness of amplification as well as efficiency in species identification, which was determined based on both the occurrence of barcoding gaps and the probability of correct identification (PCI). Analyses of the COI gene were performed based on the dataset of 43 sequences (42 obtained in this study) representing 24 species. The COI gene was discarded as a DNA barcode due to a lack of universal primer sites. For 18S rDNA analyses a dataset containing 593 sequences was used. Variable regions V2, V2-3, V4 and V8 of 18S rDNA are recommended as autotrophic euglenid barcodes due to their high efficiency in species and genera identification (above 95% and 97%, respectively) and proper length (average about 500 b.p. for V2-3 and V4 oraz 200 b.p. for V2 i V8). We designed primers that enable efficient PCR amplification of the chosen fragments and confirmed their performance in species identification in silico (based on the created reference data base) and in laboratory mixtures of euglenid cultures.