Charakterystyka strukturalna i funkcjonalna inspirowanych procesem fotosyntezy fotoaktywnych układów biohybrydowych i sztucznych makiet białkowych

Wieloetapowy proces fotosyntezy, gdzie mamy do czynienia zarówno z reakcjami fotochemicznymi jak i reakcjami transferu elektronów, jest inspiracją w projektowaniu sztucznych układów fotochemicznych i oksydoredukcyjnych. Prace te dotyczą badań wielu zróżnicowanych obiektów, m.in. niebiologicznych układów fotochemiczny wzorowanych na kompleksach barwnikowo-białkowych, układów biohybrydowych łączących kompleksy fotosyntetyczne i przewodzące podłoże elektrodowe czy minimalnych białkowych kompleksów redoks. W pracy podjęto dwa zagadnienia z tego obszaru badań: (i) zaprojektowanie i wykonanie fotoaktywnego układu biohybrydowego zbudowanego z minimalnej liczby elementów oraz (ii) doświadczalne określenie związku między strukturą polipeptydów a możliwością wiązania klastrów żelazowo-siarkowych w konstrukcji uproszczonych kompleksów redoks. Połączenie trzech elementów (i) trimerycznej formy fotosyntetycznego kompleksu antenowego LHCII (light-harvesting complex of photosystem II) (LHCII3), (ii) porowatej elektrody grafitowej (GE), oraz (iii) zastosowanie fenylo-para-benzochinonu (PPBQ), syntetycznej pochodnej chinonowej, pozwoliło zbudować nowy rodzaj fotoaktywnego układu biohybrydowego (GE-LHCII3+PPBQ). Wybór LHCII3 był związany z jego mniejszymi rozmiarami, prostszą strukturą oraz większą stabilnością w porównaniu z rdzeniowymi kompleksami fotosyntetycznymi oraz zdolnością absorpcji światła z wydajnością kwantową bliską jedności. Sitodrukowana GE jest prosta w produkcji, a jej przestrzenna struktura zbudowana z płytek grafitowych umożliwia utworzenie dużej, czynnej powierzchni elektrodowej. W tym układzie PPBQ pełnił kluczową rolę zarówno wygaszacza energii wzbudzenia w LHCII3, jak i elektrochemicznego mediatora warunkującego generowanie fotoprądu. Całościowa analiza układu biohybrydowego była możliwa dzięki zastosowaniu równoczesnego pomiaru fluorescencji chlorofilu (Chl) i generowania fotoprądów, szerokiego spektrum metod woltamperometrycznych oraz obserwacji strukturalnych in situ przy zastosowaniu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (CLSM). Pomiary zaniku fluorescencji Chl wykonane techniką modulowanej fluorescencji (PAM) wykazały, że PPBQ oddziałuje z LHCII3 proporcjonalnie do dostępnych miejsc wygaszania, a generowanie fotoprądu przez układ biohybrydowy jest bezpośrednio zależne od tego procesu. Na podstawie analiz woltamperometrycznych stwierdzono, że PPBQ tworzy kompleksy redoks z Chl zarówno w stanie podstawowym, jak i wzbudzonym, a przeprowadzone modelowanie komputerowe wskazuje na możliwość dokowania PPBQ w LHCII3 w pobliżu terminalnych emiterów wzbudzenia. Ponieważ PPBQ również ulega fotoaktywacji, tworząc pośrednie formy rodnikowe, działanie układu GE-LHCII3+PPBQ jest zależne od wzajemnego sprzężenia cykli fotoaktywacji LHCII3 i PPBQ. Badania mikroskopowe potwierdziły związanie LHCII3 z dostępnymi powierzchniami płytek grafitowych w całej przestrzennej strukturze GE. Stwierdzono także, że reakcje elektrochemiczne nie prowadzą do uszkodzenia natywnej struktury LHCII3. Badania funkcjonalne pokazały, że układ GE-LHCII3+PPBQ może generować fotoprądy anodowe w szerokim zakresie natężenia światła do wartości rzędu 5 μA∙cm-2 i wykazuje znaczną stabilność w czasie działania. Przedstawione badania wskazują na możliwość wykorzystania fotosyntetycznych kompleksów antenowych w połączeniu z pochodnymi chinonu w urządzeniach biofotowoltaicznych opartych na elektrodach węglowych. Według mojej wiedzy, jest to pierwsze doniesienie analizujące właściwości tak zaprojektowanego układu. Związek między budową strukturalna polipeptydów a możliwością wiązania oksydoredukcyjnie aktywnych klastrów żelazowo-siarkowych zbadano wykorzystując zaprojektowane de novo makiety białkowe. Analizowane polipeptydy nie występują naturalnie, posiadają prostą α-helikalną budowę i docelowo po związaniu centrów redoks mają służyć jako łączniki (akceptory/donory) w sztucznych szlakach transportu elektronów. Wykorzystano cztery pary polipeptydów, różniących się w każdej parze obecnością lub brakiem białek stabilizujących, tioredoksyny (Trx) lub białka wiążącego maltozę (MBP). Wszystkie polipeptydy w swojej sekwencji posiadały tryptofan

• ułatwiający detekcję oraz cztery cysteiny, których rozmieszczenie przestrzenne miało umożliwić koordynacje klastrów żelazowo-siarkowych typu [4Fe-4S]. W pierwszej parze białek RCM2/RCM2-Trx miejsce wiązania kofaktora w obrębie symetrycznych pętli wzorowane było na miejscu wiązania fotosyntetycznego klastra FX. Z kolei w białkach CCIS1/CCIS1-Trx motyw wiązania klastrów znajduje się w hydrofobowym rdzeniu α-helikalnej wiązki. Białka HP7-ISB/HP7-ISB-Trx oraz NCIS/NCIS-MBP tworzą formy dimeryczne a reszty cysteinowe zlokalizowane są w pętlach łańcucha peptydowego. W makietach NCIS/NCIS-MBP założono, że klaster FeS miał stabilizować strukturę i umożliwić utworzenie funkcjonalnego dipeptydu. Badane białka eksprymowano w bakteriach E. coli oraz oczyszczano wykorzystując chromatografię powinowactwa. Chemiczne wbudowanie centrów żelazowo-siarkowych do apobiałek oraz analizy strukturalne holobiałek prowadzono w warunkach beztlenowych ze względu na wrażliwość klastrów FeS na obecność tlenu. Wydajność wiązania centrów FeS, trwałość holobiałek i stopień oligomeryzacji określano stosując sączenie molekularne i pomiary absorbancji. Strukturę II-rzędową apo- i holo-białek badano przy zastosowaniu dichroizmu kołowego (CD) oraz absorbancji w dalekiej podczerwieni (FTIR). Typ związanego klastra żelazowo-siarkowego wyznaczono przy użyciu elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR). Otrzymane wyniki doświadczalne porównano z przestrzennymi modelami komputerowymi wykonanymi na podstawie sekwencji aminokwasowych makiet białkowych. Uproszczona struktura i ścisłe zdefiniowana funkcja sprawiają, że sztuczne białka są interesującym modelem badawczym. Przeprowadzone badania pozwoliły określić związek między budową domen wiążących oraz oddziaływań między peptydami na stabilność związanych klastrów FeS. Niewystępujące naturalnie motywy x18CxxxxxCx45CxxxxxCx19, x14CxxCx57CxxCx45, x27CxxxCxxCxxCx29 umożliwiły koordynacje niskopotencjałowych klastrów [4Fe-4S] o stechiometrii rombowej. Motyw x4Cx64Cx6 umożliwił wiązanie klastra typu [1Fe-0S]. Wykazano, że białka takie jak Trx lub MBP poprawiają stabilność utworzonych klastrów. Dodatkowo białka znacznikowe obniżyły multimeryzację sztucznych białek. Badania wskazują również na możliwe interakcje pomiędzy klastrami, co wydaje się niezwykle istotne przy projektowaniu sztucznych szlaków transportu elektronów.

Photosynthesis is a multistep process, where photochemical, as well as electron transfer reactions occur. Foregoing processes are inspirations for designing artificial photochemical and redox devices. These research concerns around many various objects, such as non-biological photochemical systems similar to natural pigment-protein complexes or biohybrid systems connecting photosynthetic complexes and conducted electrode materials or minimal sequences redox protein. In this research two parts of this field were analyzed: (i) designing and creating a photochemical biohybrid system built of minimal elements and (ii) describing the connection between structure and binding iron-sulfur cluster ability in artificial protein. The connection of three elements: (i) trimeric form of the light-harvesting complex of photosystem II (LHCII3), (ii) porous graphite electrode (GE), and (iii) applying phenyl-p-benzoquinone (PPBQ), synthetic derivers of quinone, allowed to create a new type of photoactive biohybrid system (GE-LHCII3+PPBQ). The choice of LHCII3 was dictated by the smaller size, simpler structure, and greater stability, comparing to the core photosynthetic complex as well as its ability to absorb light with a quantum efficiency close to unity. The screen-printed GE is easy to produce, and its three-dimensional structure made of graphite plates enables to create of a large active electrode surface. In this system, PPBQ played the key role of both the excitation energy quencher in LHCII3 and the electrochemical mediator which determinizes photocurrent generation. The comprehensive analysis of the biohybrid system was possible thanks to the simultaneous measurement of chlorophyll (Chl) fluorescence and generation of photocurrents, various voltammetric methods and using the confocal fluorescence microscope (CLSM) for in situ structural scannings. The Chl fluorescence decay measurements made by the modulated fluorescence (PAM) technique showed that PPBQ interacts with LHCII3 proportionally to the available quenching sites, and the generation of photocurrent by the biohybrid system is directly dependent on this process. Based on voltammetric analyzes, it was found that PPBQ forms complexes with Chl in both ground and excited states, and the computer modeling indicates the possibility of docking PPBQ in LHCII3 near terminal excitation emitters. Since PPBQ also undergoes photoactivation, the action of GE-LHCII3+PPBQ system is dependent on mutual coupling of LHCII3 and PPBQ photocycles. Microscopic measurements confirmed that LHCII3 penetrated the available surfaces of graphite in a three-dimension electrode structure. It was also found out that electrochemical reactions did not damage the native structure of LHCII3. The functional study showed that the GE-LHCII3+PPBQ system can generate anode photocurrents in a wide range of light intensity up to the value of 5 μA∙cm-2 and shows significant stability during operation. The presented research indicates the possibility of using photosynthetic antenna complexes in combination with quinone derivatives in biophotovoltaic devices based on carbon electrodes. To my knowledge, this is the first report analyzing the properties of a system designed in such a way. The relationship between the structure of the of polypeptides and the ability to bind active iron-sulfur cluster was investigated using de novo designed protein. The analyzed polypeptides do not occur naturally, have a simple α-helical structure and ultimately, after binding redox centers, will are to serve as linkers (acceptors/donors) in artificial electron transport pathways. Four pairs of polypeptides were used, each pair differing in the presence or absence of stabilizing proteins, thioredoxin (Trx) or maltose-binding proteins (MBP). All polypeptides in their sequence had tryptophan-facilitating detection and four cysteines which spatial distribution was to enable the coordination of iron-sulfur clusters of the [4Fe-4S] type. In the first pair of RCM2/RCM2-Trx proteins, the binding cofactor site within symmetrical loops is similar to the photosynthetic binding site of the FX cluster. The next pair, in CCIS1/CCIS1-Trx proteins, have the cluster binding motif in the hydrophobic core of the α-helical bundle. The HP7-ISB/HP7-ISB-Trx and NCIS/NCIS-MBP proteins form dimeric forms and cysteine residues are located in the loops of the peptide chain. The NCIS/NCIS-MBP assumed that the FeS cluster was to stabilize the structure and enable the formation of a functional dipeptide. Analyzing artificial proteins was expressed in E. coli bacteria and purified using affinity chromatography. Chemical incorporation of iron-sulfur centers into apoproteins and structural analyzes of holoproteins were carried out under anaerobic conditions due to the sensitivity of FeS clusters to the presence of oxygen. The binding efficiency of FeS centers, the stability of holoproteins and the degree of oligomerization were determined using gel filtration and absorbance measurements. The structure of apo- and holo-proteins was investigated using circular dichroism (CD) and infrared spectroscopy (FTIR). The type of bound iron-sulfur cluster was determined using electron paramagnetic resonance (EPR). The obtained experimental results were compared with computer models based on the amino acid sequences of protein maquettes. The simplified structure and strictly defined function make artificial proteins an interesting research model. The research allowed determined the relationship between the structure of binging domains and interactions between peptides on the stability of the bound FeS clusters. The non-naturally occurring x18CxxxxxCx45CxxxxxCx19, x14CxxCx57CxxCx45, x27CxxxCxxCxxCx29 motifs allowed for the coordination of low-potential [4Fe-4S] clusters with rhombic stoichiometry. The x4Cx64Cx6 motif enabled [1Fe-0S] cluster binding. Proteins such as Trx or MBP have been shown to improve the stability of the formed clusters. Additionally, stabilising proteins lowered multimerization of the artificial proteins. Research also indicates possible interactions between clusters, which seems to be extremely important when designing artificial electron transport pathways.