Wykorzystanie zmian polaryzacji fluorescencji oraz innych metod spektrofluorymetrycznych do badania aktywności oraz inhibicji białek oddziałujących z końcem 5’ mRNA

Struktura kapu (m7GpppN) znajdująca się na końcu 5’ mRNA poprzez specyficzne oddziaływanie z białkami wiążącymi kap warunkuje procesy składające się na ekspresję genów. Nieprawidłowa aktywność białek wiążących kap może prowadzić do zaburzeń ekspresji genów, a w konsekwencji do chorób nowotworowych lub neurodegeneracyjnych. Regulowanie aktywności białek wiążących kap może następować poprzez dostarczanie małocząsteczkowych ligandów (analogów kapu), które będą wiązać się z białkami, jednocześnie uniemożliwiając ich wiązanie z końcem 5’ mRNA. Z uwagi na potencjalne znaczenie terapeutyczne ligandów białek wiążących kap rozwijane są metody do ich efektywnego poszukiwania i charakteryzowania. Metody standardowo używane w tym celu, takie jak: miareczkowanie fluorescencyjne zsynchronizowane czasowo i izotermiczne miareczkowanie kalorymetryczne, są żmudne i czasochłonne. Do poszukiwania inhibitorów białek coraz częściej wykorzystuje się podejście wysokoprzepustowe, w którym testuje się jednocześnie ok. 80 lub więcej nowych związków chemicznych pod względem powinowactwa do białka. Podejście to w znaczący sposób zwiększa wydajność poszukiwania modyfikacji chemicznych kluczowych do oddziaływania z białkiem, jak i samych inhibitorów. Głównym celem pracy doktorskiej było opracowanie metod opartych na fluorescencji do poszukiwania i badania ligandów białek wiążących strukturę końca 5’ mRNA, czyli strukturę kapu. W pracy można wyróżnić dwie naturalnie współistniejące ze sobą części: pierwszą dotyczącą rozwoju metodologii badania oddziaływania białko-ligand oraz drugą, czyli zastosowania opracowanych metod do charakterystyki związków o nieznanych właściwościach względem białek wiążących kap. W pracy duży nacisk położono na rozwój metod wysokoprzepustowych, umożliwiających wydajne przeszukiwanie bibliotek związków w celu znalezienia tych o pożądanych właściwościach. Pierwszym podejściem rozwiniętym w ramach pracy doktorskiej do badania inhibicji enzymu DcpS jest metoda oparta na śledzeniu aktywności enzymatycznej poprzez pomiar stężenia jonów fluorkowych uwalnianych w trakcie reakcji. W metodzie wykorzystuje się nienaturalny substrat enzymu DcpS – analog m7GMPF, który jest hydrolizowany do m7GMP i jonu fluorkowego. Aby zmierzyć stężenie jonów fluorkowych wykorzystuję się sondę fluorogeniczną, w tym przypadku pochodną fluoresceiny, której grupy hydroksylowe są zabezpieczone grupami tertbutylodimetylosililowymi. Opracowana metoda była pierwszym wysokoprzepustowym podejściem do poszukiwania i charakteryzowania inhibitorów DcpS. Została ona wykorzystana do poszukiwania nowych inhibitorów tego enzymu, zarówno wśród bibliotek związków dostępnych komercyjnie, jak i tych, zsyntetyzowanych w Laboratorium Chemii Bioorganicznej. W sumie użyto jej do przetestowania 1346 związków. Wśród nich zidentyfikowano inhibitor silnie oddziałujący z enzymem DcpS (m7GSppSpSG D2), o powinowactwie zbliżonym do RG3039 – związku, który brał udział w badaniach klinicznych jako terapeutyk w leczeniu rdzeniowego zaniku mięśni. Jest to jednocześnie największe osiągnięcie projektu doktorskiego. Kolejną opracowaną metodą była anizotropia fluorescencji. Jest to podejście szeroko stosowane do badania oddziaływań białko:ligand, które w przeciwieństwie do powyżej przedstawionej metody jest jednoetapowe, a co jednocześnie oznacza, że charakterystyka ligandów z wykorzystaniem metody anizotropii fluorescencji jej szybsza. Celem mojej pracy było opracowanie metody anizotropii fluorescencji dla 3 białek: cN-IIIB, eIF4E i DcpS. W sumie przetestowano 23 układy białko:ligand do opracowania metody anizotropii fluorescencji. W przypadku enzymu cN-IIIB nie udało się opracować metody anizotropii fluorescencji ze względu na zbyt niskie powinowactwo sond fluorescencyjnych do białka. Zaś z powodzeniem metoda anizotropii fluorescencji została opracowana na białek DcpS i eIF4E, którą można używać do wysokoprzepustowego poszukiwania ligandów oraz ich charakterystyki. W przypadku badań z białkiem eIF4E, udało się rozszerzyć aplikacyjność metody - może być ona również wykorzystana do badania ligandów allosterycznych białka eIF4E, a także do oceny powinowactwa krótkich oligonukleotydów. Z uwagi na szybkość i prostotę metody anizotropii fluorescencji, stanowi ona konkurencyjne narzędzie do poszukiwania ligandów. Innym zagadnieniem poruszonym w pracy doktorskiej była charakterystyka analogów kapu modyfikowanych w pozycji C8 Guo lub m7Guo. Scharakteryzowano 14 związków pod kątem ich użyteczności jako sond do badania oddziaływania z białkami wiążącymi kap. Przeprowadzono analizę ich właściwości spektroskopowych, stabilności, a także przebadano je pod kątem oddziaływania z białkami eIF4E i DcpS. A także sprawdzono jak zmienia się intensywność fluorescencji pod wpływem aktywności hydrolitycznej enzymów DcpS i Nudt16. Największą uwagę skupiono na 6 analogach kapu charakteryzujących się wyższą wydajnością kwantową w porównaniu do naturalnej struktury kapu, były to związki zawierające znaczniki -Py, -Ph, -CNPh i DMAPh. Związki te działają jak molekularne rotory (są wrażliwe na zmiany lepkości środowiska), co można wykorzystać do badań oddziaływania z białkami. Dla każdego białka: eIF4E, DcpS i Nudt16 udało się wyłonić analog kapu, który zmienia swoje właściwości emisyjne pod wpływem wiązania z białkiem lub w wyniku zachodzącej reakcji enzymatycznej. Przedstawione badania stanowią podstawę do rozwoju nowych metod fluorescencyjnych z wykorzystaniem analogów modyfikowanych w pozycji C8 Guo lub m7Guo jako sond. Drugą część pracy doktorskiej stanowiła charakterystyka nowych analogów kapu jako ligandów białek eIF4E i DcpS z wykorzystaniem opracowanych metod fluorescencyjnych, a także standardowej metody miareczkowania fluorescencyjnego. Jako wynik prac scharakteryzowano 34 fosfotriazolowe analogi kapu, 3 analogi kapu z modyfikacją w postaci 1,5-anhydroaltritolu, 15 fosfotioestrowych analogów kapu i 17 benzylowych analogów kapu. Wykorzystanie metod fluorescencyjnych dostarczyło cennych informacji na temat wpływu modyfikacji na stabilizację kompleksy białko-ligand. Ponadto badania pozwoliły ustalić, które pozycje struktury kapu są krytyczne dla efektywnego oddziaływania białko:ligand, a także wytyczyć nowe kierunki badań.

The cap structure (m7GpppN) at the 5 'end of the mRNA determines the processes involved in gene expression through specific interaction with cap-binding proteins. Abnormal activity of cap binding proteins may lead to abnormal gene expression and, consequently, to cancer or neurodegenerative diseases. Regulation of the activity of cap-binding proteins can be accomplished by providing small-molecule ligands (cap analogs) that will bind to proteins while preventing their binding to the 5' end of mRNA. Due to the potential therapeutic importance of ligands of cap-binding protein, methods for their effective search and characterization are being developed. Standard methods used for this purpose, such as time-synchronized fluorescence titration and isothermal calorimetric titration, are tedious and time-consuming. In the search for protein inhibitors, the high-throughput approach is increasingly used, in which approximately 80 or more new chemical compounds are tested simultaneously for protein affinity. This approach significantly increases the efficiency of searching for chemical modifications that are crucial for interaction with the protein, as well as for the inhibitors themselves. The main goal of the dissertation was to develop fluorescence-based methods for the search and characterization of protein ligands binding the 5 'end structure of mRNA, i.e. the cap structure. Two naturally coexisting parts can be distinguished in the study: the first one concerning the development of the methodology for studying the protein-ligand interaction, and the second, i.e. the application of the developed methods to characterize compounds with unknown properties towards to cap-binding proteins. In this work, great emphasis was placed on the development of high-throughput methods that enable efficient searching of compound libraries to find those with desired properties. The first approach described in the PhD thesis to study the inhibition of the DcpS enzyme is a method based on monitoring enzymatic activity by measuring the concentration of fluoride ions released during the reaction. The method uses an unnatural substrate for the DcpS enzyme - m7GMPF analog, which is hydrolyzed to m7GMP and fluoride ion. To measure the concentration of fluoride ions, a fluorogenic probe is used, in this case a fluorescein derivative whose hydroxyl groups are protected with tert-butyldimethylsilyl groups. The developed method was the first high-throughput approach to search for and characterize DcpS inhibitors. It was used to search for new inhibitors of this enzyme, among libraries of commercially available compounds and those synthesized in the Laboratory of Bioorganic Chemistry. In total, it was used to test 1346 compounds. Among them, an inhibitor that interacts strongly with the DcpS enzyme (m7GSppSpSG D2) was identified, with affinity similar to RG3039, a compound that has participated in clinical trials as a therapeutic for the treatment of spinal muscular atrophy. It is also the greatest achievement of the this project. Another developed method was fluorescence anisotropy (FA). This approach is widely used to study protein: ligand interactions, which, in contrast to the above-presented method, is one-step, and which also means that the characterization of ligands using the fluorescence anisotropy method is faster. The aim of my work was to develop a fluorescence anisotropy method for 3 proteins: cN-IIIB, eIF4E and DcpS. A total of 23 protein:ligand systems were tested to develop a fluorescence anisotropy method. In the case of the cN-IIIB enzyme, it was not possible to develop a FA method due to the too low affinity of the fluorescent probes to the protein. In contrast, FA method was developed for DcpS and eIF4E proteins, and can be used for high-throughput search of ligands and their characterization. In the case of studies with the eIF4E protein, the applicability of the method was extended, it can also be used to study allosteric ligands of the eIF4E protein, as well as to assess the affinity of short oligonucleotides. Due to the speed and simplicity of the fluorescence anisotropy method, it is a competitive tool for ligand search. Another issue addressed in the dissertation was the characterization of cap analogs modified at the C8 position of Guo or m7Guo. Fourteen compounds were characterized in terms of their usefulness as probes for studying the interaction with cap-binding proteins. Their spectroscopic properties, stability were analyzed, as well as their binding affinities towards eIF4E and DcpS. It was also checked how the fluorescence intensity changes under the influence of the hydrolytic activity of the enzymes DcpS and Nudt16. The greatest attention was paid to 6 cap analogs characterized by higher quantum yields in comparison to the natural cap structure, these were compounds containing -Py, -Ph, -CNPh and DMAPh fluorophores. These compounds act as molecular rotors (they are sensitive to changes in viscosity), which can be used to study the interaction with proteins. For each protein: eIF4E, DcpS and Nudt16, it was possible to find a cap analog that changes its emission properties due to binding to the protein or as a result of an enzymatic reaction. The presented research is the basis for the development of new fluorescence methods using analogs modified at the C8 Guo or m7Guo position as fluorescent probes. The second part of the dissertation was the characterization of new cap analogs as ligands of eIF4E and DcpS proteins using the developed fluorescence based methods, as well as the standard fluorescence titration method. As a result of the work, 34 phosphotriazole cap analogs, 3 cap analogs with 1,5-anhydroaltritol modification, 15 phosphothioester cap analogs and 17 benzyl cap analogs were studied. The use of fluorescent methods provided valuable information on the influence of modifications on the stabilization of protein-ligand complexes. In addition, the research allowed to determine which positions of the cap structure are critical for effective protein: ligand interaction, as well as to set new research directions.