Bioanalityczny system przepływowy do oznaczania aktywności ureolitycznej

Ureaza [EC 3.5.1.5] jest enzymem wyizolowanym po raz pierwszy przez Sumnera w 1926 roku z fasoli Canavalia ensiformis. Ureaza jest modelowym enzymem szeroko stosowanym w badaniach kinetycznych procesów biokatalitycznych, badaniach nad nowymi sposobami unieruchamiania enzymów do zastosowań biotechnologicznych oraz rozwoju systemów analitycznych i bioczujników dla potrzeb nowoczesnej chemii analitycznej. Oznaczania aktywności ureazy dokonuje się w próbkach roślinnych, glebowych oraz kulturach bakteryjnych. Metody oznaczania biokatalitycznej aktywności ureazy bazują głównie na metodach fotometrycznych, w których wykrywa się produkty rozkładu mocznika. Do detekcji wykorzystywane są także metody konduktometryczne bądź potencjometryczne. Rutynowe procedury zazwyczaj są kilkuetapowe, co wiąże się z pracochłonnością oznaczeń. Często warunki reakcji enzymatycznej, a następnie detekcji produktu tej reakcji nie są identyczne lub wymagają kolejnych przemian chemicznych w innych warunkach, co skutkuje dalszą złożonością procedury, a te z kolei znacznie wydłużają czas pojedynczej analizy. Oznaczanie aktywności enzymów, w tym także ureazy, opiera się na pomiarze kinetycznym w ściśle określonych warunkach, w których dokładnie kontrolowany powinien być czas reakcji enzymatycznej, środowisko reakcji oraz moment dozowania reagentów. Z tymi wymaganiami najlepiej poradzą sobie metody analizy przepływowej. Nowoczesne techniki analizy przepływowej oferują wiele korzyści: mechanizację, automatyzację, optymalizację wieloetapowych procedur analitycznych jak również wysoką powtarzalność operacji pośrednich kontrolowanych mikroprocesowo. Zużycie reagentów jest minimalizowane, szczególnie gdy systemy analizy przepływowej są zmniejszane do formatu mikroprzepływowego. Układy takie odpowiednio połączone z urządzeniami modułowymi (pompy i zawory mikrosolenoidowe, detektory) zapewniają łatwe powtarzanie procedury analitycznej związanej ze zmianą parametrów każdego etapu (np. stężenia reagentów, czasów inkubacji). Niewątpliwym atutem przepływowych systemów analitycznych jest możliwość prowadzenia pomiarów równoległych (w tym różnicowych), a także wprowadzenie do systemu kolejnych próbek zanim zakończy się procedura analityczna dla poprzednich, co zapewnia zwiększenie przepustowości systemu (liczby oznaczeń w jednostce czasu). Celem pracy doktorskiej było kompleksowe podejście do oznaczania biokatalitycznej aktywności ureazy w próbkach o złożonych matrycach wykorzystując do tego techniki analizy przepływowej oraz opracowanie względnie uniwersalnego i ekonomicznego systemu do prowadzenia tych pomiarów. W toku badań wykazano, że układy przepływowe mogą pełnić rolę monitorów on-line pracujących w czasie rzeczywistym oraz, że można opracować takie systemy umożliwiające oznaczanie aktywności ureolitycznej. W finalnej części rozprawy doktorskiej skojarzono dwie możliwości - monitorowania procesów i oznaczania enzymów - zaproponowano metodę i system do monitorowania wzrostu bakterii ureolitycznych. Zmechanizowany system zmodyfikowano odpowiednio na potrzeby analizy i monitorowano w czasie rzeczywistym zmiany aktywności metabolicznej (tu: ureolitycznej) wybranych szczepów bakteryjnych. Stosując opracowany system bioanalityczny kontrolowano i badano wpływ różnych czynników na hodowlę drobnoustrojów.

Urease is a model enzyme widely used in the study of kinetic biocatalytic processes, research into new methods of enzyme immobilization for biotechnological applications and the development of analytical systems and biosensors for the needs of modern analytical chemistry. Urease determination is performed in plant and soil samples as well as in bacterial cultures. The methods of determining the biocatalytic activity of urease are mainly based on photometric methods, in which urea decomposition products are detected. Conductometric or potentiometric methods are also used for detection. Routine procedures usually consist of several stages, which makes the determinations laborious. Often the conditions of the enzymatic reaction followed by the detection of the reaction product are not identical or require further chemical transformations under different conditions, which results in further complexity of the procedure, which in turn significantly extends the time of a single analysis. Determination of enzyme activity, including urease, is based on a kinetic measurement under strictly defined conditions in which the time of the enzymatic reaction, the reaction environment and the dosing time of the reagents should be carefully controlled. It is possible thanks to the use of flow analysis methods. Modern techniques of flow analysis offer many advantages: mechanization, automation, optimization of multi-stage analytical procedures as well as high repeatability of microprocessor-controlled operations. Reagent consumption is minimized, especially when flow analysis systems are reduced to a microfluidic format. Such systems, properly connected with modular devices (pumps and microsolenoid valves, detectors), ensure easy repetition of the analytical procedure related to the change of parameters of each stage (reagent concentration, incubation time etc). An undoubted advantage of flow-through analytical systems is the possibility of conducting parallel measurements (including differential measurements), as well as introducing subsequent samples to the system before the analytical procedure for the previous ones is completed, which causes an increase in the sample throughput of system (number of determinations per time unit). The aim of the doctoral thesis was a comprehensive approach to the determination of the biocatalytic activity of urease in samples with complex matrices using flow analysis techniques to develop a relatively universal and economical system for conducting these measurements. Research has shown that flow systems can act as real-time online monitors and that such systems can be developed to measure ureolytic activity. In the final part of the doctoral dissertation, two possibilities were combined (process monitoring and enzyme determination) as well as a new method and system for monitoring the growth of ureolytic bacteria were proposed. The mechanized system was modified as needed for the analysis and the changes in metabolic activity (here: ureolytic) of selected bacterial strains were monitored in real time. Using the developed bioanalytical system, the influence of various conditions on the culture of microorganisms was controlled and studied.