New materials for the immobilization of redox enzymes on electrodes for the application in biofuel cells

W ostatnich latach połączenie biomolekuł z materiałem przewodzącym stało się ważnym tematem w elektrochemii, ze względu na możliwość konstruowania nowych urządzeń bioelektronicznych do różnorodnych zastosowań np. sensorowych czy bioogniw. Zintegrowanie enzymów, DNA czy białek receptorowych z przetwornikiem elektronicznym pozwoliło otrzymać biosensory do analizy żywności, środowiska, detekcji patogenów, diagnostyki klinicznej itd. Synergiczne efekty obserwowane po związaniu biomolekuł z rożnymi materiałami węglowymi, nanocząstkami metalicznymi czy półprzewodnikowymi mają istotne znaczenie dla rozwoju w obszarze materiałów hybrydowych o ciekawych właściwościach elektronicznych. Celem tej pracy doktorskiej było określenie właściwości katalitycznych trzech enzymów (dehydrogenazy celobiozowej Corynascus Thermophilus, dehydrogenazy D-fruktozowej oraz oksydazy bilirubinowej Myrothecium verrucaria) w formie zaadsorbowanej na węglowych nanorurkach (MWCNT), lub umieszczonej w ciekłokrystalicznej lipidowej mezofazie tzw. fazie kubicznej na powierzchni elektrod. Te dwie metody unieruchamiania enzymów na elektrodach zastosowano do przygotowania bioelektrod do redukcji i utleniania analitów, lub konstrukcji biokatod oraz bioanod do enzymatycznych ogniw jako alternatywnych źródeł zasilania.Zbadano przydatność dehydrogenazy D-fruktozy (FDH) oraz dehydrogenazy celobiozowej Corynascus thermophilus (CtCDH) jako katalizatorów anodowych. Oksydaza bilirubinowa Myrothecium verrucaria (MvBOD) była wykorzystana jako enzym na biokatodzie. Enzymy umieszczano na powierzchni elektrodowej na warstwie nanoruek węglowych na elektrodzie z węgla szklistego lub grafitu pirolitycznego, albo w monooleinowej warstwie ciekłokrystalicznej pokrywającej to samo podłoże węglowe. Aktywność katalityczną CtCDH badano w warunkach bezpośredniego (czyli bez czynnika mediującego, DET) oraz w warunkach mediowanego przeniesienia elektronu (MET). Wykorzystano dwa związki jako mediatory, przenoszące elektrony pomiędzy flawinowym centrum aktywnym enzymu i elektrodą: 2,6-dichlorofenoloindofenol (DCPIP) oraz aminowy kompleks rutenu 〖([〖Ru(NH_3)〗_6 ]Cl〗_2). Uzyskano wysokie gęstości prądu katalitycznego utleniania laktozy, odpowiednio 26.77 i 32.10 µA·cm - 2 dla DCPIP i [〖Ru(NH_3)〗_6 ]Cl_2) jako mediatorów. Dla CtCDH, jako katalizatora, zmiana z adsorpcji na unieruchomienie w matrycy ciekłokrystalicznej spowodowała wzrost gęstości prądu katalitycznego z 2.07 na 9.22 µA·cm-2, co faworyzuje ten sposób umieszczenia enzymu na elektrodzie. Jednocześnie, bardzo wzrosła trwałość w czasie układu GCE/MWCNTs/CtCDH w warstwie lipidowej – działa on przynajmniej 28 dni, podczas, gdy układ adsorpcyjny GCE/MWCNTs/CtCDHads traci zupełnie aktywność po tygodniu. Należy jednak podkreślić, że po ok. tygodniu białko to ulega częściowej degradacji a produkt degradacji może pełnić role mediatora w utlenieniu katalizowanym przez enzym nie zdegradowany. Dodatek cytochromu daje wzrost prądu katalitycznego przy podobnym potencjale, ale dokładna charakterystyka produktów rozkładu enzymu nie została jeszcze zakończona.Hydrofobowy enzym, dehydrogenaza fruktozowa - jest drugim, alternatywnym biokatalizatorem procesu utleniania cukru. Zaadsorbowana na nanorurkach węglowych lub warstwie grafenowej wykazuje dużą trwałość i katalityczną aktywność. Gęstości prądu są czterokrotnie większe niż w przypadku CtCDH jako katalizatora. Nie ma jednak dotąd struktury rentgenowskiej tego enzymu. W ramach niniejszej rozprawy spróbowano przeprowadzić krystalizację w fazach kubicznych tego białka, ale jak dotąd bez rezultatu.Katoda pokryta oksydazą bilirubinową wykazywała lepszą aktywność, gdy wykorzystano synergiczny efekt naftylowanych nanorurek węglowych i nanocząstek złotych modyfikowanych krótkim tiolem. Gęstość prądu redukcji tlenu była zadowalająca - 650 µA·cm-2. Elektroda pokryta lipidową fazą ciekłokrystaliczną z enzymem zachowywała 70% wyjściowej aktywności po 10 dniach pracy. Biokatodę Naft-MWCNTs/MvBOd połączono z anodą, zawierającą FDH lub CtCDH w celu otrzymania enzymatycznego bioogniwa. W skonstruowanym układzie była także elektroda odniesienia, umożliwiająca monitorowanie potencjału każdej z elektrod w czasie pracy bioogniwa. Potencjał biokatody był niemal stały. Efektywność całego ogniwa określała więc anoda. Gdy zastosowano fazę kubiczną na anodzie MWCNTs/CtCDH, moc bioogniwa wzrosła w porównaniu z wersją opartą o zaadsorbowany na elektrodzie. Dalszą poprawę mocy uzyskano przez pracę w warunkach przepływu nasyconego tlenem roztworu przez ogniwo, co wyeliminowało efekty związane ze zubażaniem warstwy przy elektrodzie w tlen. Praca w warunkach przepływowych dała pozytywne efekty szczególnie, gdy enzymy były w warstwie ciekłokrystalicznej – nie notowano wtedy ubywania enzymu z elektrody, co występowało czasem dla elektrod z zaadsorbowanymi enzymami. Wyznaczono parametry optymalnego ogniwa – napięcie otwartego obwodu wynosiło 540 mV. Zaproponowano także zminiaturyzowaną wersję bioogniwa, oraz nowy typ ogniwa – bioogniwo ciekłokrystaliczne: grafen/FDH//Naft-MWCNTs/MvBOD/grafen, uzyskując dwukrotne zwiększenie mocy, w porównaniu z ogniwem ciekłym o tych samych rozmiarach. Taki projekt ogniwa warto dalej optymalizować ze względu na łatwość miniaturyzacji i łatwiejszą obsługę oraz transport układu. Dysertacja jest napisana po angielsku (Valentina jest Włoszką i nie poznała jeszcze wystarczająco dobrze języka polskiego). Część wyników rozprawy została już opublikowana w czasopismach Electroanalysis i Bioelectrochemistry.

In the recent years the combination of biomolecules with electronic equipment has become a subject of interest in electrochemistry because it allows to obtain useful functional devices for many applications. The integration of enzymes, DNA and bioreceptors with electronic transducers led to the development of important specific biosensors for food, environmental analysis, detection of pathogens, clinical diagnosis, etc. Moreover, synergic effects of biomolecules combined with different carbon materials, metallic and semiconducting nanoparticles or nanostructures led to advancement in the field of hybrid materials with important electronic properties. The aim of this thesis was to investigate the catalytic properties of three different enzymes (Corynascus Thermophilus cellobiose dehydrogenase, D-fructose dehydrogenase and Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase) either adsorbed on carbon nanotubes or incorporated in liquid crystalline lipid mesophase i.e. cubic phase at electrodes. These two approaches to immobilize enzymes at the electrode surfaces were used to modify nanostructured bioelectrodes for the catalytic oxidation or reduction of analytes or as cathodes and anodes in enzymatic biofuel cells – alternative power sources.D-fructose dehydrogenase (FDH) and Corynascus thermophilus cellobiose dehydrogenase (CtCDH) were studied as anodic enzymes and Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase (MvBOD) was used on biocathode. The enzymes were placed on the electrode surface by drop-casting on carbon-nanotubes-covered glassy carbon or pyrolytic graphite electrodes or immobilized in the monoolein liquid crystalline cubic phase film covering the carbonous electrode substrate. The catalytic performance of CtCDH incorporated into the cubic phase was investigated under conditions of the direct and mediated electron transfer. In the latter case, two mediators that interact with the flavin domain of the enzyme – 2,6-Dichlorophenolindophenol (DCPIP) and amino ruthenium complex ([〖Ru(NH_3)〗_6 ]Cl_2) – were employed, giving high catalytic current densities of lactose oxidation equal to 26.77 and 32.10 µA·cm-2 for DCPIP and [〖Ru(NH_3)〗_6 ]Cl_2, respectively. The current densities of CtCDH oxidation were increased from 2.07 to 9.22 µA·cm-2 by switching from drop casting on carbon nanotubes placed at the electrode to immobilization in the lipidic cubic phase film, which favours this type of immobilization. The GCE/MWCNTs/CtCDH system in lipidic cubic phase showed activity for 28 days while GCE/MWCNTs/CtCDHads system activity dropped down after only 7 days. It should be emphasized that the increased current density of CtCDH oxidation in the LCP observed after one week of work was ascribed to partial degradation of the enzyme present in the aged film. The product of the enzyme degradation was found to play the role of mediator for the electron transfer process of the remaining intact enzyme and the potential of the process was similar to that observed after adding cyt c as the mediator to the solution. Therefore, the process of lactose oxidation was continued according to the mediated electron transfer mechanism in the aged film. A hydrophobic enzyme – Fructose dehydrogenase – was studied as the alternative enzyme for the oxidation process of sugar on the anode and was found to be very stable and catalytically active both when adsorbed on graphene layer and on the MWCNTs. The current densities were four times bigger than those obtained when CtCDH was used as the catalyst. The X-ray structure of this enzyme has not been reported, therefore, the attempt to crystallize this protein in the cubic phase was undertaken in the framework of this thesis, but the results were not satisfactory so far.The synergic effect of naphthyl-functionalised MWCNTs and gold nanoparticles protected with a short thiol lead to an improvement of the performance of the cathode covered with bilirubin oxidase. The current density of oxygen reduction to water reached 650 µA·cm-2. Moreover, this enzyme incorporated into the cubic phase film retained 70 % of the initial activity towards dioxygen reduction after ten days of work.The NaphthMWCNTs/MvBOd biocathode was combined with either FDH- or CtCDH-containing bioanode to obtain the biofuel cell systems. The potential of each of the electrodes during the biofuel cell work was measured against the reference electrode. The biocathode potential was found to be practically constant. Therefore, the anode was the factor that determined the overall performance of the biofuel cells. When cubic phase was used for the MWCNTs/CtCDH bioanode, the power output of the BFC increased compared to that of the casted enzyme. Further improvement of the power of biofuel cell was observed under solution flow conditions since under such conditions the depletion of dioxygen in the vicinity of the electrode is eliminated. In the MvBOd/ FDH biofuel cell, the enzymes placed in the cubic phase film remained on the electrode surface while the adsorbed enzymes were easily flushed away with the solution flux. The optimal open circuit voltage of the cell was estimated to be 540 mV. The lipidic cubic phase containing buffer and substrate was also studied in the liquid crystalline version of the graphene/FDH//Naphth-MWCNTs/MvBOD BFC. Its power density was ca. twice larger comparing with the one using aqueous solution containing substrates and adsorbed enzymes. Moreover, such design could be useful for further miniaturization and easier handling of the device. The dissertation is written in English because Valentina is Italian and does not speak fluent Polish. Part of the results were published in international journals: Electroanalysis and Bioelectrochemistry.