Degradacja RNA przez kompleks egzosomu

Egzosom to silnie zachowany w ewolucji wielopodjednostkowy kompleks białkowy, który prowadzi obróbkę i degradację różnych klas RNA w komórce. Jest on zbudowany z 6-elementowej podstawy i trzech białek tak zwanej czapeczki tworzących pierścień pozbawiony aktywności enzymatycznej oraz z podjednostek katalitycznych odpowiedzialnych za aktywność całego kompleksu. Egzosom znajduje się zarówno w jądrze, jaki i cytoplazmie. W zależności od organizmu, w którym występuje i lokalizacji komórkowej współdziała z różnymi białkami pomocniczymi i aktywatorowymi. Egzosom katalizuje hydrolityczną degradację RNA. Dis3 – główna podjednostka katalityczna kompleksu, jest wielodomenowym białkiem posiadającym aktywność zarówno endo-, jak i egzonukleazy 3’-5’. Za właściwości egzonukleolityczne Dis3 odpowiada domena RNB otoczona przez 3 domeny o typie zwinięcia OB (dwie "cold-shock": CSD1 i CSD2 po stronie N-terminalnej oraz S1 po stronie C-terminalnej). Ta część białka jest homologiem bakteryjnej RNazy II oraz RNazy R zdolnym do degradowania zarówno jedo-, jak i dwuniciowych substratów. Ponadto Dis3 posiada równieŜ drugą domenę katalityczną – PIN – odpowiedzialną za endonukleolityczne cięcie RNA. W komórkach wyższych Eukaryota zidentyfikowano również paralog białka Dis3 – rybonukleazę Dis3-Like. Dodatkową podjednostką katalityczną egzosomu o aktywności egzorybonukleolitycznej jest białko Rrp6. Egzosom pełni wiele kluczowych funkcji w metabolizmie RNA. W jądrze jest odpowiedzialny za przycinanie prekursora cząsteczki 5.8S rRNA, bierze również udział w dojrzewaniu innych stabilnych RNA jak snRNA i snoRNA. Ponadto, uczestniczy w degradacji produktów ubocznych powstających podczas obróbki RNA, na przykład intronów czy 5’ ETS, oraz usuwaniu niepoprawnie zsyntetyzowanych pre-mRNA, tRNA czy rRNA. W cytoplazmie egzosom degraduje wadliwe cząsteczki mRNA, które w sekwencji zawierają przedwczesny kodon stop, nie zawierają go wcale lub posiadają błędy uniemożliwiające swobodną translokację rybosomów. Kompleks hydrolizuje również prawidłowo zsyntetyzowane transkrypty w momencie, kiedy nie są juŜ komórce potrzebne. Dużo wiadomo na temat aktywności enzymatycznej egzosomu oraz jego specyficzności substratowej, natomiast funkcja nieaktywnego katalitycznie pierścienia nie została dobrze poznana. Pojawiły się dane pochodzące z badań przeprowadzonych jedynie in vitro sugerujące, że substraty RNA, które docierają do domeny katalitycznej RNB białka Dis3 przechodzą przez kanał pierścienia. Wykazano, że zmiana zachowanych w ewolucji aminokwasów w białku Rrp41 współtworzącym pierścień, potencjalnie odpowiedzialnych za oddziaływanie z RNA, powoduje zablokowanie kanału i uniemożliwia substratowi dotarcie do centrum aktywnego domeny RNB białka Dis3, hamując tym samym jego egzonukleolityczną degradację. Badania stanowiące zasadniczą część pracy doktorskiej koncentrowały się na poznaniu roli pierścienia drożdżowego egzosomu na podstawie analiz przeprowadzonych in vivo. Przygotowano szereg szczepów drożdżowych, w których zablokowano kanał i dodatkowo wprowadzono mutacje katalityczne domen katalitycznych Dis3. Przeprowadzono analizę fenotypów wzrostowych i molekularnych uzyskanych szczepów. Stwierdzono, że zablokowanie kanału pierścienia egzosomu przez zamianę czterech silnie zachowanych w ewolucji aminokwasów zasadowych na kwaśne w białku Rrp41 powoduje kumulację jądrowych substratów egzosomu oraz znaczne spowolnienie cytoplazmatycznej degradacji prawidłowo zsyntetyzowanych oraz wadliwych transkryptów. Kanał pierścienia egzosomu pełni zatem funkcję w przewodzeniu RNA docierającego do domeny RNB białka Dis3 również in vivo. Wydaje się także, że uczestniczy on w regulacji endonukleolitycznego trawienia substratów, katalizowanego przez domenę PIN. Dodatkowo, wprowadzono mutacje trzech silnie zachowanych w ewolucji aminokwasów w białku Rrp4 będącym podjednostką czapeczki pierścienia egzosomu. Zmiana tych aminokwasów, prawdopodobnie odpowiedzialnych za oddziaływanie z substratami RNA wchodzącymi do kanału, powoduje letalność drożdży oraz molekularne fenotypy charakterystyczne dla deplecji Rrp4. Uzyskane wyniki świadczą wyraźnie o istotnej roli, jaką odgrywają te ewolucyjnie zachowane aminokwasy w funkcjonowaniu egzosomu w komórce. Poza tym analizowano zdolność do komplementacji braku drożdżowego białka Dis3 przez jego ludzkie homologi: hDis3 obecny głownie w jądrze komórkowym oraz hDis3L lokalizujący się w cytoplazmie. Analizy wykazały, że jedynie hDis3, a nie hDis3L, jest zdolny do przywrócenia wzrostu drożdży, w których ekspresja endogennego DIS3 została zahamowana.

The exosome is a highly conserved, multiple-subunit protein complex responsible for processing and degradation of different RNA classes. It consists of a six element base and three proteins forming a so-called cap, that together form a ring devoid of enzymatic activity, and catalytic subunits responsible for the activity of the whole complex. The exosome is localized both in the nucleus and in the cytoplasm. Depending on the organism and its subcellular localization, it interacts with different regulatory proteins. The eukaryotic exosome digests RNA in a hydrolytic manner. The major catalytic subunit Dis3 is a multidomain protein endowed with both endo- and 3’ to 5’ exonuclease activities. The exonuclease activity resides within the RNB domain supported by 3 OB-fold domains (two cold-shock: CSD1 and CSD2 at the N-terminal side and S1 at the C-terminal side). This part of the protein is homologous to bacterial RNase II and RNase R and is capable of degrading both single- and double-stranded substrates. In addition, Dis3 also has also another catalytic domain – PIN – responsible for endoribonucleolytic activity. In cells of higher eukaryotes a paralogue of Dis3 was also identified – the ribonuclease Dis3-Like. Another catalytic subunit of the exosome is the Rrp6 protein, which is an active exonuclease. The exosome plays crucial roles in RNA metabolism. In the nucleus, the complex is responsible for trimming of a 5.8S rRNA precursor and participates in processing of other stable RNA classes, like snRNA or snoRNA. The exosome is involved in degradation of RNA processing by-products, for example introns or the 5’ ETS, and in removal of incorrectly synthesized pre-mRNA, tRNA or rRNA. In the cytoplasm, the exosome degrades aberrant mRNA molecules, with premature termination codons, without stop codons at all, or ones that cause ribosomes to stall during translation. The complex also hydrolyzes properly synthesized transcripts, when they are no longer needed. Much was known about the enzymatic activity and substrate specificity of the exosome, however the function of the catalytically-inactive ring remained poorly characterized. In vitro data suggesting that RNA substrates reaching the catalytic RNB domain of Dis3 protein go through the ring channel had been published. It was shown that the substitution of conserved amino acids in Rrp41 protein (one of the ring subunits) which are probably responsible for the interaction with the RNA that is to be digested exonucleolytically by the Dis3 protein, causes channel blockage and prevents substrate from reaching the active site of Dis3 RNB domain, thus inhibiting its exonucleolytic degradation. The major part of this PhD dissertation is concentrated on investigating the yeast exosome ring function based on in vivo analysis. A set of yeast mutant strains was constructed in which the ring channel was blocked and additional catalytic mutations were introduced into the Dis3 catalytic domains. Growth and molecular phenotype analysis of the obtained yeast strains was performed. The blockage of the ring channel caused by the change of four conserved basic amino acid residues in the Rrp41 protein into acidic leads to the accumulation of nuclear exosome substrates and significantly slows down the degradation of proper and aberrant cytoplasmic transcripts. The exosome ring plays a role in channelling the RNA substrates reaching the Dis3 protein RNB domain also in vivo. Moreover, it seems to take part in the endonucleolytic digestion catalyzed by the PIN domain as well. Additionally, mutation of three evolutionary conserved amino acids was introduced into Rrp4 protein from exosome ring’s cap structure. Changing these residues, which are suspected to be responsible for interaction with RNA substrates entering the ring channel, caused yeast lethality and molecular phenotypes the same as those caused by depletion of Rrp4. Such results clearly demonstrate the great importance of these conserved amino acids in exosome functionality in the cell. In parallel, a yeast complementation assay was performed to compare the properties of human homologues of the yeast Dis3 protein. A plasmid carrying one of the human genes: DIS3 encoding protein present mainly in the nucleus or DIS3L encoding protein localized in the cytoplasm was introduced into a yeast strain, in which expression of endogenous DIS3 was suppressed. Only hDIS3 was able to restore the growth inhibition, whereas the presence of hDIS3L did not reverse the phenotype.