Effect of selected elicitors on grapevine (Vitis vinifera) primary and secondary metabolism: focus on stilbenes and triterpenoids

Rozwój przyjaznych dla środowiska alternatywnych metod ochrony winorośli (Vitis vinifera) przeciw szkodnikom zyskuje na znaczeniu w kontekście zapobiegania nadmiernemu użyciu pestycydów i promowania zrównoważonego rolnictwa. Indukcja naturalnej obrony roślin poprzez działanie elicytorów (stymulatorów odporności roślin) jest jedną z najbardziej obiecujących metod kontroli biologicznej, jako że opiera się na zastosowaniu substancji biodegradowalnych i nietoksycznych dla środowiska i zdrowia ludzi. Elicytory zaaplikowane na roślinę wyzwalają w niej mechanizmy obronne, prowadząc do rozwijania odporności na kolejne ataki patogenów. Percepcja elicytora uruchamia szlaki sygnałowe, z których najbardziej kluczowe są te związane z kwasem salicylowym (SA), kwasem jasmonowym (JA) lub etylenem (ET). Konsekwencje aktywowania kaskady reakcji odpornościowych to m.in. indukcja ekspresji genów związanych z obroną, np. kodujących białka związane z patogenezą (PR), czy enzymy odpowiedzialne za biosyntezę wyspecjalizowanych metabolitów o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych (przede wszystkim stilbenów u roślin z rodziny Vitaceae). Stymulatory odporności roślin są obecnie stosowane jako uzupełnienie pestycydów, a nie jako środek zastępczy, ponieważ ich skuteczność jest często zmienna w zależności od konkretnego patogena i warunków środowiskowych. W celu opracowania strategii ochrony winorośli przed chorobami całkowicie opartych na elicytorach, potrzeba jest wielu badań, które pozwolą m.in. wyjaśnić mechanizm działania tych środków. Celem niniejszej pracy było zbadanie odpowiedzi winorośli na elicytory o różnej aktywności biologicznej: jasmonian metylu (MeJA), związany ze szlakiem sygnałowym JA, benzotiadiazol (BTH), syntetyczny analog SA oraz sole fosforanowe (PHOS), o działaniu stymulującym, jak i grzybobójczym. Profil steroidów i triterpenoidów pentacyklicznych winorośli scharakteryzowano za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS). Potencjalny wpływ MeJA na profil triterpenoidów oceniono w hodowlach zawiesin komórkowych in vitro V. vinifera. W zależności od badanej odmiany, zaobserwowano wzmożoną biosyntezę triterpenoidów pentacycklicznych, takich jak betulina (Petit Verdot) i kwas oleanolowy (Gamay Teinturier), a także fitosteroli (Cabernet Sauvignon). W elicytowanych liściach szklarniowych sadzonek Cabernet Sauvignon, wykazano konkurencyjność szlaków biosyntezy triterpenoidow, tzn. zwiększona akumulacja triterpenoidow pentacyklicznych, związanych z chemiczną obroną roślin, odbyła się kosztem biosyntezy steroli, związków niezbędnych dla budowy i funkcjonowania błon komórkowych. Dzięki analizom z wykorzystaniem mikromacierzy NeoVigen i ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UHPLC-MS), w liściach poddanych elicytacji stwierdzono akumulację transkryptów związanych z obroną oraz zwiększoną zawartość polifenoli (stilbenów, flawanoli i flawonoli). Biotesty na krążkach liściowych wykazały, że badane elicytory nadały odporność liściom przeciwko Plasmopara viticola, tj. patogenowi wywołującemu mączniaka rzekomego. Ponadto, badanie wpływu elicytorów na metabolizm pierwotny jest istotny w celu zapewnienia roślinie swoistego kompromisu między aktywowaniem kosztownych energetycznie mechanizmów obronnych, a utrzymaniem prawidłowego funkcjonowania podstawowych procesów fizjologicznych. Badania metabolomiczne z wykorzystaniem spektroskopii protonowego jądrowego rezonansu magnetycznego (1H-NMR) wykazały szereg istotnych zmian w profilu węglowodanów, aminokwasów i niektórych substratów cyklu Krebsa w liściach poddanych elicytacji. Wyniki badań przedstawione w niniejszej rozprawie wykazują, iż dokładne zrozumienie interakcji między elicytorem, odpowiedzią molekularną i metaboliczną rośliny a patogenem, ma kluczowe znaczenie dla rozwoju skutecznych strategii obrony winorośli przed chorobami, opartych na stymulatorach odporności roślin.

In the frame of promoting sustainable vitiviniculture, the development of eco-friendly alternatives to synthetic chemical products for phytosanitary treatments against grapevine (Vitis vinifera) pests is gaining importance. One of the bio-control methods that can be proposed is the induction of plant immunity by using elicitors, also called plant defense stimulators (PDS), as these substances are biodegradable and, non-toxic to health and environment. A conferred resistance against various pathogens can be obtained with natural molecules acting most frequently through jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and/or ethylene (ET) signaling pathways. These pathways are involved in the induction of defense-related genes such as those encoding enzymes responsible for the biosynthesis of stilbenes, which are the most important polyphenolic antimicrobial metabolites (phytoalexins) in Vitaceae. For vineyard protection, PDS can be applied as a complement for pesticides and not as a full replacement since their effectiveness is often variable according to pathogens and environmental conditions. In order to develop the strategies based on PDS use, more studies which could elucidate their mechanism of action are needed. The aim of this thesis was to examine the responses of grapevine to elicitors of different mode of action, as methyl jasmonate (MeJA), implicated in JA signaling pathway, 2,1,3-benzothiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH), a synthetic analogue of SA, and phosphonates (PHOS), molecules of a double stimulator-fungicide action. Due to scarce information about steroids and pentacyclic triterpenoids in grapevine, their profile after PDS treatment were characterized in different grapevine experimental models using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analyses. Firstly, the effect of elicitation with MeJA was evaluated in cell suspension cultures (in vitro) of V. vinifera. An overproduction of bioactive pentacyclic triterpenoids occurred with differences according to the cultivar studied, i.e., acumulation of betulin and oleanolic acid or phytosterols was noted in respectively Petit Verdot, Gamay Teinturier and Cabernet Sauvignon cell suspension cultures. Then, elicitations were effectuated on the leaves of V. vinifera cv. Cabernet Sauvignon greenhouse cuttings. A stimulatory effect on the potentially defense-related pentacyclic triterpenoids at the expense of the biosynthesis of sterols, which are essential structural components of cell membranes, was shown. By the use of NeoVigen microarrays, and ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC-MS), the accumulation of defense-related transcripts and polyphenols (stilbenes, flavanols and flavonols) were noted after the three elicitors treatments. Grapevine protection conferred by these elicitors was confirmed on foliar discs against the biotrophic oomycete Plasmopara viticola, the causal agent of downy mildew. Furthermore, the impact of PDS on primary metabolism should be evaluated in order to ensure, in the longer term, the best trade-off between growth, yield and defense. Thus, a thorough metabolomic approach using proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR) was performed. A reprogramming similar and/or specific to the elicitor applied was noted, particularly within carbohydrates, amino acids, and some of the Krebs cycle intermediates. The research presented in the current dissertation revealed that the thorough comprehension of the interaction between elicitor, plant molecular and metabolic responses and pathogen, is crucial for the development of effective protection strategies based on the use of PDS for grapevine diseases control.