Redukowany tlenek grafenu jako podłoże dla enzymów

Eksperymenty opisane w niniejszej pracy dotyczyły syntezy tlenku grafenu i jego redukcji metodami chemicznymi i elektrochemicznymi w celu wykorzystania otrzymanego materiału jako podłoża dla lakazy (Lac) i peroksydazy chrzanowej (HRP). Tlenek grafenu przed i po elektroredukcji był badany pod kątem zawartości grup funkcyjnych, zmian w morfologii oraz możliwości zastosowania wraz z unieruchomionym enzymem jako elektroda. Podstawowymi technikami pomiarowymi, stosowanymi w niniejszej pracy były techniki woltamperometryczne, uzupełnione przez wyniki otrzymane za pomocą mikroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR). Zmiany struktury i morfologia powierzchni próbek obrazowana była z zastosowaniem mikroskopii elektronowej oraz spektroskopii dyspersji energii promieniowania rentgenowskiego (EDS). Wśród przeprowadzonych badań mogę wyróżnić cztery wiodące zagadnienia: - synteza tlenku grafenu, ze szczególnym uwzględnieniem metodyki procesu utleniania grafitu, przez zastosowanie metody zmodyfikowanej syntezy Hummera-Offemana; - opracowanie efektywnej metody redukcji tlenku grafenu, pozwalającej na otrzymanie struktur złożonych z kilku do kilkunastu warstw grafenowych, odznaczających się obecnością tlenowych grup funkcyjnych; - kondycjonowanie tlenku grafenu w wodzie amoniakalnej (NH3 aq) w celu wprowadzenia na powierzchnię warstw grafenowych azotowych grup funkcyjnych; - preparatykę elektrody, bazującej na tlenku grafenu lub redukowanym tlenku grafenu i wybranym enzymie redoks oraz badanie przydatności wytworzonej elektrody do pracy w roli biosensora. W pierwszej części badany był proces utleniania grafitu, czyli wprowadzania ugrupowań zawierających tlen w przestrzenie między warstwami grafenowymi. W tym celu wykorzystano zmodyfikowaną syntezę Hummera-Offemana. Otrzymany produkt poddano analizie z zastosowaniem techniki spektroskopii w podczerwieni oraz spektroskopii dyspersji energii promieniowania rentgenowskiego (EDS). Badania wykonano aby ocenić zawartość tlenu w materiale i określić udział poszczególnych grup tlenowych. Do zdiagnozowania zmian morfologii warstw grafenowych przed i po utlenieniu posłużyła mikroskopia elektronowa: transmisyjna (TEM) oraz skaningowa (SEM). W drugiej części rozprawy zawarte są badania procesu redukcji tlenku grafenu metodami chemicznymi i elektrochemicznymi. Tlenek grafenu traktowany był odpowiednią substancją redukującą lub poddawany woltamperometrycznej redukcji. Ubytek tlenu oraz wszelkie zmiany struktury były monitorowane z wykorzystaniem technik takich jak mikroskopia w podczerwieni oraz mikroskopia elektronowa. W ramach tej części pracy doktorskiej opracowana została metoda kontrolowania ilości tlenowych grup funkcyjnych na powierzchni tlenku grafenu dzięki zastosowaniu odpowiedniego czasu trwania procesu elektrochemicznej redukcji jego warstw. Trzecia część rozprawy dotyczyła wprowadzenia na powierzchnię warstw grafenowych azotowych grup funkcyjnych poprzez kondycjonowanie otrzymanego tlenku grafenu w wodzie amoniakalnej (NH3 aq). Kondycjonowanie tlenku grafenu w NH3 aq spowodowało, że dzięki obecności elektroaktywnych grup azotowych na powierzchni warstw tlenek grafenu wykazywał aktywność katalityczną względem redukcji nadtlenku wodoru (H2O2). Wprowadzenie i analiza azotowych grup funkcyjnych na powierzchni tlenku grafenu pozwoliła precyzyjnie ocenić przydatność i użyteczność tlenku grafenu kondycjonowanego w wodzie amoniakalnej (NH3 aq) w budowie sensorów chemicznych. Dodatkowo, zbadano wpływ kondycjonowania warstw tlenku grafenu w roztworze wody amoniakalnej (NH3 aq) na ich trwałość. Czwarte zagadnienie, poruszone w rozprawie, dotyczyło wykorzystania warstw tlenku grafenu i redukowanego tlenku grafenu jako podłoża dla unieruchomienia enzymów: lakazy (Lac) lub peroksydazy chrzanowej (HRP). Enzymy te katalizują odpowiednio: lakaza – redukcję tlenu (O2), peroksydaza chrzanowa – redukcję nadtlenku wodoru (H2O2). Właściwości elektrokatalityczne unieruchomionych enzymów badano za pomocą technik woltamperometrycznych oraz chronoamperometrycznych w celu określenia czułości względem analitu oraz możliwości zastosowania w biosensorach. Wartości potencjału i prądu odpowiadającego redukcji analitu stanowiły miarę właściwości elektrokatalitycznych. Szczególną uwagę poświeciłam dwóm rodzajom układów. Układ z matrycą ze zredukowanego tlenku grafenu, na którego warstwach unieruchomiono lakazę (Lac), okazał się wykazywać bezpośredni transfer elektronów podczas redukcji molekularnego tlenu (O2). Materiałem elektrycznie aktywnym względem redukcji nadtlenku wodoru (H2O2) okazał się także układ, zawierający peroksydazę chrzanową (HRP) oraz tlenek grafenu kondycjonowany w wodzie amoniakalnej (NH3 aq) i redukowany elektrochemicznie.

The experiments described in this dissertation involves the study of the graphene oxide synthesis and reduction by chemical or electrochemical methods in order to use the resulting material as a substrate for laccase (Lac) and horseradish peroxidase (HRP). Before and after the electroreduction graphene oxide has been tested for functional group content, morphology and the ability to be used with the immobilized enzyme as an electrode. The basic techniques used in this study were voltammetric techniques, supported by results from infrared microscopy with Fourier Transform (FTIR). Changes in the structure and morphology of the surface were visualized using electron microscopy and X-ray energy dispersive spectroscopy (EDS). In terms of the study I can distinguish four leading issues: - graphene oxide synthesis by the modified Hummer-Offeman method; - development of effective method for reducing graphene oxide that allows to obtain structures from a few to several layers of graphene with a content of oxygen functional groups; - conditioning graphene oxide in ammonia water (NH3 aq) in order to introduce the nitrogen surface groups onto the graphene layers; - preparation of electrodes based on graphene oxide and reduced graphene oxide with immobilized redox enzyme and study the suitability of those electrodes to function as a biosensor. In the first part of thesis, oxidation of graphite was tested for the introduction of oxygen-containing groups into the spaces between the graphene layers. For this purpose, modified Hummer-Offeman method of synthesis was used. The obtained product was analyzed by infrared spectroscopy technique and X-ray energy dispersive spectroscopy (EDS). These studies were performed to assess the oxygen content in the material and to determine the participation of oxygen functional groups. To diagnose changes in the morphology of graphene layers before and after oxidation transmission and scanning electron microscopy was used. The second part of the thesis contains the description of reducing process of graphene oxide by using chemical and electrochemical methods. Graphene oxide was treated with a chemical reducing substance or was reduced by voltammetric methods. The loss of oxygen and the changes of the structure were examined by techniques such as infrared microscopy and electron microscopy. In this part of the thesis, method of controlling the amount of oxygen functional groups on the surface of graphene oxide, has been developed by supervising the stages of electrochemical reduction. The third part of the dissertation refers to the introduction of the nitrogen functional groups onto the surface of graphene layers by conditioning graphene oxide in ammonia water (NH3 aq). Conditioned graphene oxide, due to the presence of electroactive nitrogen groups on the surface of layers, exhibited catalytic activity during reduction of hydrogen peroxide (H2O2). Introduction and analysis of the nitrogen functional groups on the surface of the graphene oxide allowed to assess the significance and usefulness of graphene oxide conditioned in ammonia water (NH3 aq) in the construction of chemical sensors. In addition, the durability of conditioned graphene oxide layers was analyzed. The fourth issue, considered in the dissertation, refers to the use of the prepared layers of graphene oxide and reduced graphene oxide as a base for the immobilization of enzymes: laccase (Lac) or horseradish peroxidase (HRP). These enzymes catalyze, respectively: laccase – reduction of oxygen (O2), horseradish peroxidase – reduction of hydrogen peroxide (H2O2). Electrocatalytic properties of immobilized enzymes were studied using voltammetric and chronoamperometric methods to determine the sensitivity relative to the analyte and possible applications in biosensors. Current and potential values of the analyte reduction were a measure of the electrocatalytic properties. Particular attention was given to two types of systems. First system had reduced graphene oxide layers as a matrix on which laccase (Lac) was immobilized. This system occurred to exhibit direct electron transfer during the reduction of molecular oxygen (O2). Second system was electrically active during the reduction of hydrogen peroxide (H2O2) and was based on reduced graphene oxide conditioned in ammonia water (NH3 aq) with bounded horseradish peroxidase (HRP).