Rola modulatora ścieżki sygnałowej WNT, R-spondyny 3 w morfogenezie, rozwoju oraz cyklu regeneracyjnym włosa

Mieszki włosowe myszy powstają w wyniku interakcji naskórka ze skórą właściwą, a ich rozwój regulują liczne szlaki sygnałowe, z których kluczową rolę pełni kanoniczna ścieżka Wnt (ang. Wingless-type MMTV integration site family). Multipotentne komórki macierzyste mieszka włosowego (HFSCs, ang. Hair Follicle Stem Cells), zlokalizowane w wybrzuszeniu (Bu, ang. Bulge) odpowiadają za regenerację skóry i jej przydatków. Mieszki przechodzą przez cykl regeneracyjny obejmujący fazy wzrostu (anagenu), regresji (katagenu) oraz spoczynku (telogenu). Badania naszego laboratorium wykazały, że homeostaza HFSCs zależy od równowagi między ścieżką sygnałową białka morfogenetycznego kości (BMP, ang. Bone Morphogenetic Protein signaling) a Wnt. Mimo dobrze poznanej roli ścieżki Wnt, działanie jej modulatorów pozostaje niedostatecznie zbadane. Celem mojej pracy doktorskiej było określenie wpływu nadekspresji jednego z nich, R-spondyny 3 (Rspo3), na morfogenezę, rozwój i regenerację mieszków włosowych. Badania przeprowadzono na dwóch modelach myszy transgenicznych z systemem Cre-LoxP. W pierwszym, z promotorem keratyny 14 (K14), nadekspresja Rspo3 była konstytutywna w skórze i jej przydatkach od wczesnej morfogenezy. W drugim, gen kodujący rekombinazę Cre, sprzężoną ze skróconym receptorem progesteronu (PR) pod promotorem K15, pozwalał na indukcję nadekspresji Rspo3 specyficznie w HFSCs po podaniu analogu progesteronu. Oba modele zawierały reporter wzmocnionego białka żółtej fluorescencji (eYFP, ang. enhanced Yellow Fluorescent Protein), umożliwiający wizualizację ekspresji Rspo3. W modelu z konstytutywną nadekspresją Rspo3 obserwowano fenotyp z rzadkimi włosami i obszarami alopecji, wynikający z obniżonej proliferacji i zwiększonej apoptozy komórek progenitorowych macierzy włosa, co skutkowało przedwczesnym przejściem mieszków włosowych z fazy wzrostu do regresji. Myszy te miały więcej włosów zależnych od aktywności kanonicznej ścieżki Wnt, przy jednoczesnym spadku całkowitej liczby włosów. Ponadto, zaobserwowano opóźnione tworzenie przedwybrzuszenia (ang. Pre-Bulge) podczas morfogenezy oraz przedłużoną niedojrzałość populacji HFSCs w okresie rozwoju pourodzeniowego, co prowadziło do upośledzenia regeneracji włosów przez całe życie tych myszy. Badania in vitro również potwierdziły hamujący wpływ konstytutywnej nadekspresji Rspo3 na proliferację, migrację i zdolność keratynocytów do tworzenia kolonii. Z kolei, w modelu z indukowaną postnatalnie nadekspresją Rspo3 w HFSCs zaobserwowano przyspieszenie anagenu oraz zwiększenie proliferacji komórek mieszka włosowego, co skutkowało szybszym odrostem włosów. Analiza sekwencjonowania RNA (RNA-seq) HFSCs po indukcji nadekspresji Rspo3 ujawniła geny docelowe istotne dla aktywacji Rspo3. Porównanie ich z genami sygnaturowymi dla spoczynkowych HFSCs wykazało, że aż 98% genów wspólnych wykazuje przeciwstawną, obniżoną ekspresję po indukcji nadekspresji Rspo3, wskazując na wczesną aktywację HFSCs. Dalsze porównanie z modelem przedwczesnej aktywacji HFSCs, myszy z nieaktywną ścieżką BMP w HFSCs, ujawniło 78% zgodność zmian ekspresji genów wspólnych dla obu modeli. Pozwoliło to na odkrycie mechanizmu molekularnego z przeciwstawnie obniżoną ekspresją genów sygnaturowych dla stanu spoczynkowego HFSCs, zmniejszoną aktywnością szlaku BMP i niekanonicznej ścieżki Wnt, którym towarzyszyła zwiększona ekspresja genów aktywujących kanoniczną ścieżkę Wnt. Wyniki te dowodzą, że postnatalna nadekspresja Rspo3 w HFSCs prowadzi do ich przedwczesnej aktywacji i przyspieszenia przebiegu cyklu regeneracyjnego włosa. Podsumowując, badania te pogłębiły wiedzę o roli Rspo3 w morfogenezie, rozwoju i regeneracji mieszków włosowych. Ujawniono również mechanizm molekularny wczesnej aktywacji HFSCs wywołanej nadekspresją Rspo3, co pozwoliło lepiej zrozumieć wewnętrzną oscylację sieci genów zmienionych przez nadekspresję Rspo3 w cyklu regeneracyjnym włosa. Otrzymane wyniki mogą przyczynić się do rozwoju nowych terapii przeciwko alopecji.

Mouse hair follicles are formed by the interaction of the epidermis with the dermis, and their development is regulated by multiple signaling pathways, of which the canonical Wnt pathway (Wingless-type MMTV integration site family) plays a key role. Multipotent hair follicle stem cells (HFSCs), located in the bulge (Bu) are responsible for the regeneration of the skin and its appendages. The follicles go through a regenerative cycle that includes growth (anagen), regression (catagen), and quiescence (telogen) phases. Studies conducted in our laboratory showed that HFSC homeostasis depends on the balance between the Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling pathway and Wnt. Despite the well-known role of the Wnt pathway, the action of its modulators remains insufficiently studied. My doctoral thesis aimed to determine the effect of overexpression of one of them, R-spondin 3 (Rspo3), on hair follicle morphogenesis, development, and regeneration. The studies were conducted on two transgenic mouse models with the Cre-LoxP system. In the first one, with the keratin 14 (K14) promoter, Rspo3 overexpression was constitutive in the skin and its appendages from early morphogenesis. In the second one, the gene encoding Cre recombinase, coupled to a shortened progesterone receptor (PR) under the K15 promoter, allowed the induction of Rspo3 overexpression specifically in HFSCs after progesterone analogue treatment. Both models contained an enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) reporter, enabling visualization of Rspo3 expression. In the model with constitutive overexpression of Rspo3, a sparse hair phenotype with areas of alopecia was observed, resulting from reduced proliferation and increased apoptosis of hair matrix progenitor cells, leading to premature transition of hair follicles from growth phase to regression. These mice had more canonical Wnt pathway-dependent hair, while the total number of hairs decreased. Moreover, delayed pre-bulge formation during morphogenesis and prolonged immaturity of the HFSC population during postnatal development were observed, leading to impaired hair regeneration across the lifespan of these mice. In vitro studies also confirmed the inhibitory effect of the constitutive overexpression of Rspo3 on keratinocyte proliferation, migration, and colony-forming capacity. In turn, in the model with postnatally induced Rspo3 overexpression in HFSCs, an acceleration of anagen and increased hair follicle cell proliferation were observed, which resulted in faster hair regrowth. Analysis of RNA sequencing (RNA-seq) from HFSCs after induction of Rspo3 overexpression revealed target genes important for Rspo3 activation. Comparison of them with signature genes for quiescent HFSCs showed that as many as 98% of common genes showed opposite, reduced expression after induction of Rspo3 overexpression, indicating early activation of HFSCs. Further comparison with the model of premature activation of HFSCs, mice with an inactive BMP pathway in HFSCs, revealed 78% concordance of expression changes of genes common to both models. This allowed us to discover a molecular mechanism with oppositely downregulated expression of genes maintaining the quiescent state of HFSCs, reduced activity of the BMP and non-canonical Wnt pathways, along with elevated expression of genes activating the canonical Wnt pathway. These results prove that postnatal overexpression of Rspo3 in HFSCs leads to their premature activation and acceleration of the hair regeneration cycle. In summary, these studies have deepened the understanding of the role of Rspo3 in hair follicle morphogenesis, development, and regeneration. They also revealed the molecular mechanism of premature activation of HFSCs induced by Rspo3 overexpression, revealing the intrinsic oscillation of gene networks altered by Rspo3 overexpression during the hair regeneration cycle. The obtained results may contribute to the development of new therapies against alopecia.