Fizykochemiczne badanie oddziaływania wybranych związków interkalujących DNA z modelowymi układami błon biologicznych

Antybiotyki przeciwnowotworowe, w tym antracykliny są obecnie najskuteczniejszym i najczęściej wybieranym rodzajem terapii w onkologii. Mechanizm ich oddziaływania na poszczególne organelle i procesy w komórkach nowotworowych jest bardzo skomplikowany. Jednak wprowadzony do organizmu terapeutyk, zanim dotrze do wnętrza komórek musi w pierwszej kolejności pokonać barierę błony biologicznej, która chroni komórki oraz tkanki i narządy. Sposób przenikania leku do wnętrza komórek zależy od wielu czynników, w tym nie tylko od właściwości fizykochemicznych terapeutyku, ale w dużym stopniu na proces ten ma wpływ struktura i własności błony biologicznej. W przedstawionej rozprawie omówione zostały badania zmierzające do poznania sposobu transportu dwóch wybranych leków przeciwnowotworowych: doksorubicyny i mitoksantronu przez membrany biomimetyczne. Omawiane w pracy leki należą do najczęściej aplikowanych farmaceutyków w leczeniu nowotworów systemowych jednak wydaje się, że penetracja terapeutyku może prowadzić do zaburzeń struktury dwuwarstwy lipidowej skutkując trwałym uszkodzeniem błon komórkowych, szczególnie kardiomiocytów. Stąd też bardzo istotne jest zbadanie mechanizmu penetracji antracyklin do wnętrza komórki. Zastosowanie w opisanych badaniach szeregu membran modelujących naturalne błony biologiczne umożliwiło całościowy opis problematyki i szczegółowe poznanie procesu wnikania leków do komórki. W pierwszym, najobszerniejszym fragmencie pracy omówiłam sposób interakcji leku doksorubicyny z membranami biomimetycznymi tworzonymi metodą samoorganizacji, techniką Langmuira-Blodgett/Langmuira-Shaeffera oraz metodą fuzji liposomów. Druga część badań dotyczy odziaływania leku mitoksantron z układami wykazującymi analogię do błon komórkowych. W tym fragmencie pracy zrezygnowałam z wykorzystania techniki samoorganizacji oraz związków alkanotiolowych na korzyść techniki Langmuira oraz Langmuira-Blodgett. Różnorodność metod oraz związków stosowanych do otrzymywania błon biomimetycznych pozwoliła na wytworzenie struktur posiadających odmienne właściwości oraz zróżnicowany stopień podobieństwa do naturalnych błon biologicznych. Do otrzymywania membran metodą samoorganizacji wykorzystane zostały dwa związki posiadające różne grupy funkcyjne tj. merkaptoundekanol i dodekanotiol. Umożliwiło to otrzymanie na powierzchni złota dwóch układów wykazujących odmienne właściwości hydrofilowo-hydrofobowe oraz zbadanie wpływu tych właściwości na adsorpcję doksorubicyny i przenikanie do wnętrza struktur. W każdym przypadku modyfikacja elektrody alkanotiolem powoduje wytworzenie wysokiej bariery energetycznej dla leku. Eksperymenty elektrochemiczne połączone z pomiarami grawimetrycznymi oraz techniką SPR pokazują, iż doksorubicyna bardzo łatwo adsorbuje się na powierzchniach hydrofilowych, utrudniając dalszą penetrację leku do monowarstwy. Interakcja antracykliny z monowarstwami hydrofobowymi polega głównie na wnikaniu cząsteczek leku między łańcuchy węglowodorowe membrany. Przedstawione badania potwierdzają hipotezy występujące w literaturze, że cząsteczki doksorubicyny adsorbujące się na polarnych częściach lipidów utrudniają przenikanie leku poprzez membranę. Inną zastosowaną w pracy metodą tworzenia monowarstw biomimetycznych była technika Langmuira-Blodgett. Filmy Langmuira po przeniesieniu na podłoże substratu (warstwy Langmuira – Blodgett) stanowią idealny model błony komórkowej, ponieważ dwuwarstwa lipidowa będąca podstawą błony biologicznej jest złożeniem dwóch warstw monomolekularnych. W tym przypadku monitorowanie interakcji leków z membranami odbywało się na dwa sposoby: na powierzchni subfazy wanny Langmuira (filmy Langmuira) oraz po przeniesieniu warstw na substrat stały jak złoto, srebro czy mika (filmy Langmuira- Blodgett). Dwutorowość przeprowadzonych eksperymentów pozwoliła na określenie sposobu oddziaływania antracykliny z dwoma regionami membrany, jednym o charakterze hydrofilowym (warstwy Langmuira), drugim o charakterze hydrofobowym (monowarstwy L-B). Do tworzenia filmów wykorzystywane były zarówno związki przypominające budową lipidy jak i sam lipid-fosfatydylocholina, co umożliwiło stworzenie warstw o płynnej, luźnej strukturze i stopniu upakowania odzwierciedlającym budowę naturalnych błon biologicznych. Badania z zastosowaniem filmów Langmuira pokazują, że obydwa leki penetrują hydrofilowe głowy monowarstw i pomimo bardzo dobrej rozpuszczalności w wodzie wbudowują się w strukturę membrany na subfazie. Interakcje antybiotyków z monowarstwami po osadzeniu ich na substracie pozwoliły na określenie sposobu interakcji z hydrofobowymi „ogonami” węglowodorowymi w membranie. Okazuje się, że lek wnika w strukturę hydrofobową warstwy i w zależności od stopnia organizacji filmu możliwy jest różny stopień rotacji molekuł leku w membranie. Istnieje różnica w sposobie uwalniania leków z monowarstw L–B. Pomiary metodą woltamperometrii cyklicznej pokazują, że proces płukania powoduje usunięcie większości mitoksantronu z monowarstwy, co nie miało miejsca w przypadku pierwszego z badanych leków - doksorubicyny. Można to tłumaczyć inną budową cząsteczek obu antybiotyków. Występowanie w strukturze doksorubicyny aminocukru – daunozaminy stwarza większą zawadę przestrzenną i powoduje trudniejsze wychodzenie tego leku z membran. W przypadku dwuwarstwy lipidowej zarówno doksorubicyna jak i mitoksantron nie są w stanie całkowicie pokonać podwójnej struktury membrany. Pomiary elektrochemiczne dowodzą, że antybiotyki penetrują jedynie zewnętrzną część błony biomimetycznej. Wewnętrza warstwa lipidowa L-B/L-S, a także utworzona w wyniku fuzji liposomów powoduje odizolowanie leku od powierzchni elektrody, co uniemożliwia transport elektronów między cząsteczką antybiotyku a metalem. Podsumowując, badania przedstawione w mojej rozprawie doktorskiej pozwoliły określić sposób penetracji antybiotyków antracyklinowych do wnętrza biomimetycznych układów mono- i dwuwarstwowych w zależności od ich budowy i właściwości. Wyniki uzyskane podczas realizacji pracy doktorskiej zostały opublikowane w czasopismach międzynarodowych: Langmuir, Bioelectrochemistry oraz Journal of Electroanalytical Chemistry.