Oznaczanie stężenia melatoniny u pacjentów z patologiami szyszynki

Celem pracy było opracowanie metody oznaczania melatoniny w próbkach biologicznych z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją fluorymetryczną (HPLC-FLD) oraz ocena stężenia tego związku u pacjentów z patologiami szyszynki i u zdrowych wolontariuszy. W ramach badań zoptymalizowano procedurę przygotowania próbek surowicy, obejmującą deproteinację oraz ekstrakcję melatoniny do fazy stałej (SPE). Zastosowanie kwasu mrówkowego do wytrącania białek pozwoliło na uzyskanie odpowiednich warunków do dalszej ekstrakcji, podczas gdy wykorzystanie acetonitrylu prowadziło do utraty melatoniny podczas etapu SPE. Selektywność oznaczenia potwierdzono z wykorzystaniem LC-MS/MS, wykazując rozdzielenie melatoniny od serotoniny i 6-hydroksymelatoniny. Oceniono również stabilność melatoniny podczas przechowywania w temperaturze −20°C i −80°C oraz odzysk analitu po ekstrakcji SPE, który wynosił 94–104% dla badanych próbek surowicy. Opracowaną metodę zastosowano do oznaczenia melatoniny w próbkach pochodzących od ośmiu pacjentów z patologiami szyszynki oraz od siedmiu zdrowych wolontariuszy. U większości pacjentów stężenie melatoniny znajdowało się poniżej granicy wykrywalności metody, wynoszącej 25 pg/ml, natomiast u zdrowych wolontariuszy oznaczane stężenia sięgały 180 pg/ml. Ze względu na niewielką liczebność grupy badanej uzyskane wyniki nie pozwalają na wyciągnięcie jednoznacznych wniosków, jednak wskazują na tendencję do niższych stężeń melatoniny u pacjentów z patologiami szyszynki oraz dalszego obniżenia jej stężenia po zabiegu operacyjnym.

The aim of this study was to develop a method for determining melatonin in biological samples using high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection (HPLC-FLD) and to assess the concentration of this compound in patients with pineal pathologies and healthy volunteers. The study optimized the serum sample preparation procedure, which included deproteinization and solid-phase extraction (SPE) of melatonin. The use of formic acid for protein precipitation allowed for the creation of suitable conditions for further extraction, whereas the use of acetonitrile led to the loss of melatonin during the SPE step. The selectivity of the assay was confirmed using LC-MS/MS, demonstrating the separation of melatonin from serotonin and 6-hydroxymelatonin. Melatonin stability during storage at −20°C and −80°C was also assessed, as was the analyte recovery after SPE extraction, which was 94–104% for the serum samples tested. The developed method was used to determine melatonin in samples from eight patients with pineal pathologies and seven healthy volunteers. In most patients, melatonin concentrations were below the method's detection limit of 25 pg/ml, while in healthy volunteers, concentrations reached 180 pg/ml. Due to the small size of the study group, the obtained results do not allow for drawing clear conclusions; however, they indicate a trend toward lower melatonin concentrations in patients with pineal pathologies and a further reduction in melatonin concentrations after surgery.