Cykliczne peptydy o aktywności antyangiogennej

Angiogeneza jest procesem biologicznym, który polega na tworzeniu się nowych naczyń krwionośnych z już istniejących w organizmie. Patologiczna forma angiogenezy jest odpowiedzialna za pojawienie się choroby nowotworowej. Jednym z głównych czynników proangiogennych jest czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGFA165, określany jako VEGF165), który w sposób selektywny oddziałuje z receptorem (VEGFR) oraz ko-receptorem, którym jest białko neuropilina 1 (NRP-1). Ekspresję NRP-1 obserwuje się na wielu typach nowotworów co sugeruje, że NRP-1 w komórkach nowotworowych może pełnić funkcje osobnego receptora dla VEGF165. Związki, które są w stanie zablokować w sposób selektywny interakcję VEGF165/NRP-1 mogą stać się w przyszłości lekami stosowanymi w chorobach nowotworowych. Celem mojej pracy doktorskiej było projektowanie, synteza oraz badania biologiczne cyklicznych peptydów, których struktura oparta jest na najkrótszym fragmencie heptapeptydu A7R (ATWLPPR) w celu znalezienia silnych inhibitorów układu VEGF165/NRP-1. Peptyd A7R został wyizolowany z biblioteki fagowej przez zespół prof. Perreta. Peptyd ten wykazuje w testach in vivo oraz in vitro właściwości antyangiogenne. Badania struktura – aktywność (SAR) peptydu A7R wykazały, że C- końcowy fragment LPPR jest kluczowy w wykazywaniu przez ten peptyd aktywności biologicznej. Moje badania dotyczyły syntezy cyklicznych peptydów, gdyż są one stabilniejsze w surowicy ludzkiej krwi w odróżnieni od ich liniowych odpowiedników. Ta właściwość czyni je bardziej odpowiednimi potencjalnymi kandydatami na leki. Struktura zaprojektowanych cyklicznych peptydów oparta była na sekwencji LPPR. Zaprojektowane cykliczne peptydy posiadały dwa rodzaje cyklizacji: łańcuch boczny –do- łańcucha bocznego oraz głowa – do – łańcucha bocznego. Każdy zaprojektowany peptyd posiadał na C-końcu resztę argininy, która okazała się być kluczowym aminokwasem w wykazywaniu aktywności biologicznej przez peptyd A7R oraz LPPR. Cyklizacja została przeprowadzona za pomocą utworzenia wiązania amidowego pomiędzy pierwszą a trzecią resztą aminokwasu obecnego w sekwencji LPPR. W zależności od przeprowadzonej cyklizacji peptydy różniły się ilością atomów w cyklu (10-15). Synteza liniowych peptydów oraz cyklizacja została przeprowadzona manualnie korzystając z metody syntezy peptydów na nośniku polimerowym (SPPS), wykorzystując w tym celu nośnik polimerowy Merrifielda oraz prowadząc całą syntezę w oparciu o strategię Fmoc/Boc. Cyklizacja została wykonana za pomocą TBTU. Peptydy były oczyszczane za pomocą RP HPLC i analizowane za pomocą spektrometrii mas. Wydajności zaprojektowanych cyklicznych peptydów były zazwyczaj niskie. W zależności od rodzaju cyklicznego peptydu w surowym produkcie znajdował się cykliczny monomer, mieszanina cyklicznego peptydu w postaci monomeru wraz z symetrycznym dimerem bądź tylko cykliczny dimer. Świadczy to o tym, że synteza małych cyklicznych peptydów jest wyzwaniem. Otrzymałam 15 peptydów (7 cyklicznych monomerów oraz 8 cyklicznych dimerów), których stopień inhibicji układu VEGF165/NRP-1 został zbadany za pomocą testu ELISA. Większość otrzymanych cyklicznych peptydów wykazywała wyższą aktywność niż peptyd A7R. Dla większości cyklicznych monomerów oraz jednego dimeru zostało wykonane modelowanie komputerowe. Struktury peptydów dokowane były do domeny b1 kokryształu NRP-1 z tuftsyną (tetrapeptyd TKPR ― jeden z inhibitorów NRP-1). Modelowanie komputerowe dowiodło, że reszta egzocyklicznej argininy odgrywa kluczową rolę w oddziaływaniu z receptorem a grupa aminowa znajdująca się na N-końcu odpowiedzialna jest za oddziaływanie z Glu348 znajdującym się w NRP-1. Wyniki testu ELISA oraz modelowanie komputerowe wykazało, że zarówno wielkość pierścienia jak i konfiguracja reszt aminokwasów obecnych w sekwencji peptydu jest kluczowa do wykazywania wysokiej aktywności biologicznej przez analizowane peptydy. Dla trzech najbardziej aktywnych peptydów zostały wykonane badania stabilności w surowicy ludzkiej krwi korzystając z metody LC MS. Badania wykazały, że peptydy te są stabilne w surowicy ludzkiej krwi. Czas półtrwania w zależności od badanego peptydu wahał się od 5 h (monomer) do 32 h (dimer). Ostatni etap mojej pracy dotyczył optymalizacji syntezy cyklicznych peptydów. W tym celu wykorzystałam różne rodzaje nośników polimerowych (Wang, Wang Tenta Gel), odczynników sprzęgających (TBTU, DIC/Oksyma, HATU), różne warunki prowadzenia reakcji (temperatura pokojowa, reaktor mikrofalowy). Wyniki moich badań wykazały, że wydajność otrzymania produktu monomerycznego zależy głównie od sekwencji oraz od rodzaju zastosowanej cyklizacji.

Angiogenesis is a biological process described as creation of new blood vessels from pre-existing ones. Pathological form of this process is crucial during cancer development process. One of the most important protein which takes part in angiogenesis is vascular endothelial growth factor (VEGFA165, also known as VEGF165), which selectively binds to its receptor (VEGFR) and co-receptor – protein called neuropilin-1 (NRP-1). In the recent years expression of NRP-1 has been demonstrated in various types of tumours what suggests that NRP-1 in tumour cells may serve as a separate receptor for VEGF165. Therefore compounds which are able to block selectively VEGF165/NRP-1 interaction seem to be promising candidates as a new anti-angiogenic and anti-tumour drugs. The aim of my thesis was design, synthesis and biological evaluation of cyclic peptides based on the shortest active part of heptapeptide A7R (ATWLPPR) to obtain potent inhibitors VEGF165/NRP-1 system. A7R peptide was isolated from the phage library by professor Perret’s group who showed in in vitro and in vivo tests anti-angiogenic and anti-tumour properties of this peptide. Structure activity relationship study (SAR) of A7R showed that the most important for biological activity is C-terminal tetrapeptide (LPPR). My research was focused on synthesis of cyclic peptides, because they are much more stable in human plasma than their linear counterparts what makes them more suitable as prospective candidate as drugs. However, the problem is always whether cyclic compounds will maintain (or improve) their biological activity. Based on the LPPR sequence two types of cyclic peptides were designed. One type with side chain-to-side chain type of cyclization, and second type with head-to-side chain type of cyclization. All designed cyclic peptides possessed exocyclic C-terminal arginine as this amino acid residue is essential for biological activity of A7R and LPPR. Cyclization was performed by an amide bond formation between 1st and 3rd amino acid residue in LPPR sequence. Depend on the type of cyclization peptides differed by the number of atoms in the cycle (10-15). Synthesis of linear peptide chains and cyclization were performed manually using SPPS methodology on Merrifield resin according to Fmoc/Boc strategy. Cyclization reaction was performed with the use of TBTU coupling reagent. Peptides were purified by RP HPLC method and analysed by MS methods. Yields of desired cyclic peptides were rather low. In the products of cyclization, depend on particular cyclic peptide, beside the desire cyclic monomer, mixture of monomer and symmetrical dimer, or only All obtained 15 peptides (7 cyclic monomers and 8 cyclic dimers) were examined in vitro for their inhibitory on VEGF165/NRP-1 binding using competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Most of synthesized cyclic peptides were found as potent inhibitors and showed higher inhibitory effect than A7R. To have more deep insight into the SAR results of the synthetized peptides molecular modeling was performed for most cyclic monomers and one cyclic dimer. The structures of peptides were docked into b1 domain of NRP-1 co-crystalized with tuftsin (one of the NRP-1 inhibitors, with the sequence TLPRR). Docking analysis suggested that for cyclic peptides, besides Arg which position was similar as for Arg of tuftsin, the key structural feature for the inhibitory effect is the N-terminal amino group of the cyclic peptides that can interact with Glu348 residue in NRP-1. The results of ELISA test and molecular modelling showed that both the ring size and configuration of amino acid residues present in the structure are crucial for high inhibitory effect. Three of the most active peptides were tested for their stability in human plasma by LC MS methods. These cyclic peptides turned to be quite stable, their half-life were approximately from 5 h for monomers, up to 32 h in the case of cyclic dimer. The last part of my research concerned the optimization of the synthesis of cyclic peptides. The effect of type of resin (Wang, Wang Tenta Gel), coupling reagents (TBTU, DIC/Oxyma, HATU) and different reaction conditions (room temperature and microwave radiation) on the yield of desired cyclic peptides were examined. The results of my study showed that the yield of monomeric product depends mostly on sequence of peptide and type of cyclization.