Badania metodami biofizycznymi procesu przyjmowania struktury natywnej i właściwości białek z rodziny GFP

Białko zielonej fluorescencji, GFP, pochodzące z meduzy Aequorea victoria, jest pierwszym odkrytym z rodziny białek fluorescencyjnych, które stały się popularnymi znacznikami fluorescencyjnymi stosowanymi w wizualizacji procesów zachodzących w komórkach. Białka fluorescencyjne wykorzystywane są m.in. do monitorowania zachowania makromolekuł w czasie rzeczywistym, jako białka reporterowe, jako specyficzne biosensory zmian pH i stężenia jonów, a także dzięki wykorzystaniu zjawiska rezonansowego transferu energii Förster’a (FRET) np. do badania zwijania białek lub obserwacji łączenia się ligandów z docelowymi obiektami. Są one uważane za znacznik obojętny dla organizmów żywych. Właściwości fluorescencyjne GFP zyskuje po utworzeniu struktury natywnej podczas reakcji autokatalitycznej, w której uczestniczą trzy aminokwasy: seryna 65 ‒ tyrozyna 66 ‒ glicyna 67. W jej wyniku powstaje chromofor zdolny do absorpcji i emisji światła w zakresie widzialnym. Chromofor stanowi trwałą post-translacyjną modyfikację łańcucha polipeptydowego, która może wpływać na przebieg procesu powtórnego zwijania w porównaniu ze zwijaniem białka, które jeszcze nigdy go nie utworzyło (zwijanie de novo). W niniejszej pracy przedstawiłam wyniki badań przeprowadzonych dla mutanta GFP o wzmocnionej fluorescencji (EGFP) porównujące zwijanie de novo z opisanym w literaturze powtórnym zwijaniem Na tej podstawie zaproponowałam po raz pierwszy model zwijania de novo i powtórnego zwijania uwzględniający zjawisko agregacji. Zasugerowałam również interpretację poszczególnych faz tych procesów. Korzystając z różnorodnych metod spektroskopowych stwierdziłam, że obecność chromoforu wpływa na stan rozwiniętego białka w pH 1 oraz na przebieg zwijania i towarzyszącej mu agregacji. Zwijanie powtórne i de novo jest wieloetapowe, podąża równoległymi ścieżkami zwijania, a największe różnice występują w fazach początkowych, w tym również w czasie martwym pomiaru. Jedynie w przypadku powtórnego zwijania niektóre fazy związane są wyłącznie ze zmianami fluorescencji chromoforu, a zatem i jego otoczenia, natomiast w obydwu przypadkach fałdowania występuje zjawisko izomeryzacji prolin. Podczas powtórnego zwijania 90% intensywności świecenia białka uzyskuje się po ok. 20 min., natomiast dla zwijania de novo czas ten, ze względu na tworzenie chromoforu, wynosi około godziny. Agregacja towarzysząca fałdowaniu EGFP różni się dynamiką procesu i jego wydajnością ‒ gdy jest związana z powtórnym zwijaniem, faza nukleacji jest krótsza, natomiast wydajność jest mniejsza w porównaniu z wynikami uzyskanymi podczas fałdowania de novo. Zatem duże znaczenie dla wyników badań prowadzonych z udziałem GFP jako znacznika fluorescencyjnego ma fakt, czy użyto białka, które dopiero utworzy, czy już posiada dojrzały chromofor. Dodatkowe eksperymenty dotyczące agregacji podczas zwijania de novo, wykonane metodą ultrawirowania analitycznego, wykazały, że właściwości fluorescencyjne posiada jedynie prawidłowo zwinięty monomer EGFP. Natomiast pomiary absorpcyjne wskazały na występowanie nieświecących form zagregowanego białka i monomerów bez funkcjonalnego chromoforu. Jest zatem istotne, by w badaniach wykorzystujących obserwację GFP jako markera fluorescencyjnego uwzględniać możliwość występowania nieświecących form białka, których pominięcie może powodować błędy w interpretacji danych. Przeprowadzając badania nad przyczyną braku fluorescencji mutanta S65T/G67A-GFP w porównaniu z białkiem S65T-GFP, włączyliśmy się do trwającej od blisko 30 lat dyskusji dotyczącej mechanizmu tworzenia chromoforu. Pomiary spektrometrii mas wskazują, że w białku S65T/G67A-GFP podczas procesu formowania chromoforu została zablokowana reakcja utleniania. Co za tym idzie, przynajmniej dla rodziny białek GFP z mutacją S65T tworzenie chromoforu przebiega w kolejności: cyklizacja ‒ dehydratacja ‒ utlenianie. Jednym z badanych zjawisk była zdolność białka GFP do wytwarzania nowych lub wygaszania reaktywnych form tlenu (ROS). Do oceny tych właściwości wykorzystaliśmy pomiary metodą elektronowego rezonansowego paramagnetycznego. Wyniki eksperymentów świadczą o braku predyspozycji do wytwarzania ROS przez EGFP, w przeciwieństwie do niektórych białek fluorescencyjnych, np. KillerRed. Natomiast EGFP wykazywało zdolność wygaszania ROS, za co, jak wykazaliśmy, może być odpowiedzialny chromofor ulegający uszkodzeniu pod wpływem wolnych rodników powstających podczas intensywnego oświetlenia. Zatem, podobnie jak sugeruje się dla białek fluorescencyjnych występujących w koralowcach, GFP może pełnić rolę fotoochronną. Wydajność wygaszania ROS przez EGFP była porównywalna z tą obserwowaną dla BSA i papainy, które wykazują działanie ochronne przed ROS. Uzyskałam również nowe mutanty białka EGFP: C48S-EGFP i C70S-EGFP, posiadające w sekwencji pojedynczą cysteinę. Wprowadzone mutacje nie wpłynęły na właściwości absorpcyjne i fluorescencyjne chromoforu, natomiast w porównaniu z C70S-EGFP mutant C48S-EGFP jest bardziej stabilny i ma krótszy czas dojrzewania chromoforu. Jest on więc bardziej odpowiedni do badań właściwości białek fluorescencyjnych z użyciem na przykład znaczników spinowych, wybiórczo wiążących się z cysteinami i charakteryzujących ich najbliższe otoczenie

Green Fluorescent Protein (GFP) from jellyfish Aequorea victoria is the first discovered protein from Fluorescent Proteins family (FPs), which became widely used fluorescent markers, especially in the visualization of processes in cells. Fluorescent proteins are applied e.g. in the real-time monitoring of molecules behaviour, as reporter proteins, as pH and ion concentration biosensors, as well as, due to Förster Resonance Energy Transfer (FRET), in protein folding research or in monitoring the process of ligand binding. FPs are considered as labels neutral for living organisms. GFP becomes fluorescent after adopting the native structure, when autocatalytical reaction between three residues (Ser65-Tyr66-Gly67) occurs resulting in formation of chromophore absorbing and emitting in the visible range. Chromophore is a persistent post-translational modification of polypeptide chain, which might affect refolding process in comparison with protein, which has never created chromophore (de novo folding). This dissertation presents results of research on GFP mutant with enhanced fluorescence properties (EGFP) comparing de novo folding with the refolding process described in literature. For the first time I have proposed the possible model of progress of refolding, de novo folding including an aggregation associated and, moreover, the probable interpretation of each phase of the process. Using multiple spectroscopic methods I have discovered that chromophore presence affects state of unfolded protein at pH 1 and the protein folding as well as aggregation. Refolding and de novo folding are both multistage, parallel-pathway processes and the main difference is observed at the beginning of folding, including the measurement dead time. Only in refolding some phases are related exclusively to the changes in chromophore fluorescence showing alterations in its environment. Both refolding and de novo folding reveal proline isomerization. It takes around 20 min. to acquire 90% of chromophore fluorescence intensity for refolding, while for de novo folding this time is extended to around an hour, due to chromophore formation. Aggregation accompanying folding differs in the dynamic of the process and in its efficiency ‒ when it is related to refolding, the nucleation phase is shorter but efficiency is lower in comparison to the results obtained during de novo folding. Therefore, it is of significance for the results of research using GFP as fluorescent marker, if the applied protein has the matured chromophore or not. Additional experiments on aggregation accompanying de novo folding, performed using analytical ultracentrifugation, showed that fluorescent is only EGFP monomer with proper protein structure and matured chromophore. However, absorption measurements indicated presence of non-fluorescent aggregated forms and monomers without functional chromophore. Therefore, it is important in experiments using GFP fluorescence as an indicator to consider the possibility of presence of non-fluorescent protein forms, which may cause misinterpretation of the results received, if neglected. Investigating the reason for the lack of fluorescence in S65T/G67A-GFP mutant in comparison to S65T-GFP we got involved in 30-year discussion about mechanisms of chromophore formation. Mass spectrometry results indicated that oxidation reaction was suppressed in S65T/G67A-GFP. Thus, for GFP family with S65T mutation the chromophore formation follows the sequence: cyclisation ‒dehydration ‒ oxidation. GFP is also suspected to generate or scavenge reactive oxygen species (ROS). To confirm these properties we used Electron Paramagnetic Resonance (EPR) measurements. Experiment results showed that in contrast to some FPs, e.g. KillerRed, EGFP is not capable to generate, but it can scavenge ROS. We indicated that this property might be caused by chromophore damage by free radicals produced under intensive illumination. Therefore, GFP may fulfil photoprotective role, as it is also suggested for FPs from corals. ROS scavenging efficiency for EGFP was comparable to that observed for BSA and papain, which are known for protective function against ROS. Moreover, I have created new EGFP single-cysteine mutants: C48S-EGFP and C70S-EGFP. Mutations did not alter either absorption or fluorescence properties of chromophore, however, C48S-EGFP is more stable and has shorter chromophore maturation time in comparison to C70S-EGFP. Thus, C48S-EGFP is more suitable for studying the properties of FPs using e.g. spin labels binding exclusively with cysteines and characterising the label’s nearest surroundings.