Badanie struktury i właściwości wieloskładnikowych dwuwarstw lipidowych oraz ich oddziaływań z antybiotykami peptydowymi

Celem przeprowadzonych badań w ramach pracy doktorskiej było określenie właściwości fizycznych modelowych warstw biomimetycznych o zróżnicowanym składzie lipidowym. Mikroskopia sił atomowych (AFM) pozwoliła na zobrazowanie struktury dwuwarstw lipidowych oraz identyfikację poszczególnych faz, a tym samym pozwoliła na weryfikację możliwości powstawania domen lipidowych. Wprowadzenie peptydów antybiotykowych do środowiska warstw biomimetycznych pozwoliło na zbadanie charakteru i specyficzności oddziaływania tego typu cząsteczek z lipidami. Przegląd literaturowy rozprawy zawiera opis budowy błon komórkowych, ze szczególnym uwzględnieniem raftów lipidowych oraz układów biomimetycznych i metod ich otrzymywania. W tej części pracy omówiona również została charakterystyka antybiotyków peptydowych (melityny i lizeniny) i ich oddziaływań z błonami komórkowymi i modelowymi dwuwarstwami lipidowymi. Część eksperymentalną, poświęconą aparaturze pomiarowej, odczynnikom i sprzętowi laboratoryjnemu, poprzedza opis technik pomiarowych stosowanych w pracy. W rozdziale 10 opisano wyniki badań własnych związanych z formowaniem dwuwarstw DPPC, za pośrednictwem techniki rozkładania liposomów, przeprowadzonym na dwóch różnych substratach stałych - mice posiadającej właściwości hydrofilowe oraz złocie o właściwościach hydrofobowych i w różnych warunkach eksperymentalnych. W kolejnym rozdziale opisano rezultaty eksperymentów, które pozwoliły na przedstawienie mechanizmu procesu rozkładania liposomów DMPC/cholesterol (7/3) na powierzchni złota Au(111). Poprzez kontrolowanie potencjału przyłożonego do elektrody złotej, możliwe było spowolnienie procesów adsorpcyjnych oraz procesów związanych z reorganizacją struktur lipidowych na powierzchni substratu, a tym samym obserwację kolejnych etapów tworzenia dwuwarstwy lipidowej. Rozdział 12 poświęcony został opisowi badań związanych z wyznaczeniem właściwości wieloskładnikowych błon biomimetycznych zwierających w swoim składzie DOPC, sfingomielinę (HSM) oraz cholesterol w różnych stosunkach molowych. Zastosowanie techniki Langmuira oraz mikroskopii AFM pozwoliło na zobrazowanie zmian w strukturze i organizacji dwuwarstw bezpośrednio powiązanych z ich składem lipidowym. Analiza wyników badań uzyskanych za pomocą obydwu technik wykazała, w których z badanych układów lipidowych ma miejsce separacja faz i tworzenie się domen lipidowych o przeważającej zawartości jednego ze składników - DOPC lub HSM. W rozdziale 13 przeprowadzono opis i analizę wyników badań eksperymentalnych związanych z oddziaływaniem i zmianami strukturalnymi wywołanymi działaniem melityny wobec trójskładnikowej błony biomimetycznej DOPC/HSM/cholesterol 7/7/6. Wykazano, że wprowadzenie melityny do środowiska błon biomimetycznych skutkowało stopniową ewolucją zmian strukturalnych dwuwarstwy - obserwowano tworzenie defektów w strukturze biomimetyków oraz przemiany strukturalne towarzyszące wnikaniu peptydu do wnętrza błony. W kolejnym rozdziale opisano rezultaty badań opierające się o wykorzystanie zmodyfikowanych sond mikroskopu AFM do obrazowania i badania siły oddziaływania pomiędzy cząsteczkami lizeniny i tryptofanu a składnikami dwuwarstwy lipidowej DOPC/HSM 1/1. Zaobserwowano, że lizenina wykazuje tendencję do specyficznego wiązania się z powierzchnią błon biomimetycznych w obszarach bogatych w sfingomielinę (wartość siły wiązania cząsteczek sfingomieliny przez lizeninę została oszacowana na ~125 pN). W ostatnim rozdziale przedstawiono wysokorozdzielcze zdjęcia otrzymane za pomocą skaningowej mikroskopii tunelowej, na podstawie których możliwa była molekularna analiza struktur adsorpcyjnych fosforodihydroceramidu oraz mieszaniny fosforodihydroceramid/cholesterol na powierzchni substratu złotego Au(111).

The aim of this thesis was to investigate the physical properties of biomimetic model membranes of different lipid composition. Atomic force microscopy (AFM) experiments were performed to illustrate the topography and structure of the lipid bilayers and identification of different structural phases. The influence of the natural antimicrobial peptides on model multicomponent bilayers was investigated and provided information on the peptide-induced structural changes of membranes. The literature review describes the architecture of cell membranes in particular emphasis on lipid rafts, biomimetic systems and bilayers preparation methods. In this part of thesis was also discussed the antibiotic peptides characteristic (melittin and lysenin) and their interactions with cell membranes and model biomimetics. In the experimental section, instrumentation used, measurement techniques and reagents equipment are described. The results of experiments presented in the chapter 10 describe formation of DPPC bilayers acquired with liposomes fusion technique carried out in different experimental conditions on two different solid substrates - hydrophilic mica and hydrophobic gold. In the next chapter the mechanism of DMPC/cholesterol (7/3) liposomes fusion and spreading process on the gold Au(111) surface was described. Employed potential controlled gold electrode allowed to evaluate the details of lipid bilayer formation with respect to the processes associated with the lipids reorganization on the gold substrate. In the chapter 12 properties of Langmuir and solid supported mixed lipid films of DOPC, sphingomyelin (HSM) and cholesterol in different molar ratios were described. Langmuir technique and AFM microscopy allowed to illustrate structural changes and organization of bilayers directly related to lipid composition. Results analysis provide valuable characteristic of morphology, packing properties, domains structures and phase coexistence in the investigated systems with respect to the lipid-dominant component - DOPC or HSM. Studies described in the chapter 13 was to examine the influence of the antimicrobial peptide, melittin, on the properties of model lipid membranes composed of DOPC/HSM/cholesterol. The changes in the structure of the lipid bilayers caused by the presence of peptide were observed using AFM microscopy. Imaging revealed interesting time-dependent structural changes of investigated membranes and indicates that melittin disturbs the membrane, probably by inducing formation of pores or larger defects. In the next chapter atomic force microscopy (AFM) and force measurements were applied to investigate the interaction of protein, lysenin, and amino acid tryptophan with lipid bilayer contains sphingomyelin. Results indicate that the AFM tips conjugated with lysenin are useful to detect the surface distribution of HSM-rich membrane domains. It became possible to detect the localization of HSM clusters and also to measure the mechanical properties of lysenin-sphingomyelin interaction (adhesion force of lysenin and HSM was obtained around ~125 pN). In the last chapter scanning tunneling microscopy (EC-STM) has been applied to study the structure of the film formed by fusion of dihydroceramidephosphate (PDHC) suspensions and mixed PDHC/cholesterol vesicles on a Au(111) electrode surface. EC-STM was used to obtain images of the potential-assisted assembled monolayer with molecular resolution. In case of pure PDHC, images revealed formation of two-dimensional ordered layer quite similar to the packing of glycerophospholipids at Au(111). High resolution images of PDHC/cholesterol mixture allowed to evaluate molecular arrangement behavior.