The impact of Npl3 protein on the specificity of pre-mRNA splicing in yeast

W celu lepszego zrozumienia mechanistycznych konsekwencji niewydajnego tworzenia spliceosomu, podczas wykonywania swojej pracy magisterskiej przeprowadziłam selekcję supresorów mutacji G5a w intronie, która zaburza parowanie substratu zarówno z U1 snRNA, jak i z U6 snRNA. W wyniku selekcji zidentyfikowałam mutanty w białkach Npl3 oraz Mtr10. Oba białka są ze sobą powiązane funkcjonalnie. Npl3 to białko podobne do eukariotycznych białek SR. Wędruje ono pomiędzy cytoplazmą a jądrem i wpływa na praktycznie wszystkie etapy biogenezy mRNA, m.in. splicing oraz eksport z jądra do cytoplazmy. Mtr10 to karioferyna odpowiedzialna za re-import Npl3 z cytoplazmy do jądra. W tej rozprawie scharakteryzowałam zarówno poprzednio uzyskane, jak i nowo-zidentyfikowane mutanty, oraz pokazałam, że zarówno mutanty npl3 jak i mtr10 zaburzają nukleocytoplazmatyczną wędrówkę białka Npl3. Powoduje to obniżenie poziomu jądrowego Npl3 i poprawę splicingu niekanonicznych (suboptymalnych) substratów pre-mRNA. Co ciekawe, zmiany w eksporcie RNA również poprawiają splicing intronów o suboptymalnych sekwencjach miejsc splicingowych. Zaproponowany przeze mnie model zakłada, że obserwowana poprawa splicingu jest uzyskiwana na dwa sposoby. Po pierwsze, destabilizacja oddziaływania Npl3-Mtr10 prowadzi do niewydajnego re-importu Npl3 do jądra. Po drugie, defektywne interakcje pomiędzy Npl3 a maszynerią eksportową spowalniają transport mRNA do cytoplazmy. Oba te mechanizmy dają więcej czasu na utworzenie spliceosomów na suboptymalnych intronach, zostawiając więcej czasu na dokończenie splicingu suboptymalnych substratów przed ich eksportem do cytoplazmy. Co ciekawe, analiza RNA-seq wybranych szczepów supresorowych sugeruje, że zwiększona częstość wyboru potencjalnie nieprawidłowych miejsc splicingowych, powodowana np. przez mutanty npl3, jest modulowana przez mechanizm zwrotny hamujący splicing poprzez ograniczenie dostępności ważnych białkowych składników spliceosomu, np. białka Prp5. Ponadto, nieprawidłowe miejsca splicingowe wybierane w szczepach supresorowych mogą angażować kompleksy spliceosomowe, skutkując zmniejszeniem dostępności spliceosomów dla pozostałych, kanonicznych intronów, powodując generalne obniżenie wydajności splicingu. Podsumowując, moje wyniki wskazują, że obniżony poziom białka Npl3 w jądrze komórkowym prowadzi do mniej rygorystycznego wyboru miejsc splicingowych przez spliceosom, ujawniając nieznaną poprzednio funkcję tego białka w modulacji specyficzności działania spliceosomu. Białko to zachowuje się więc jak białka SR wyższych eukariontów, które modulują wzory alternatywnego splicingu.

To gain a broader view of the mechanistic consequences of inefficient spliceosome assembly, I have previously carried out an open genetic screen for alleles that improve splicing of 5'SS-G5a introns, which are defective in binding to both U1 and U6 snRNAs. The screen identified alleles of npl3 and mtr10, encoding two functionally linked proteins, Npl3 and Mtr10. Npl3 is primarily nuclear, shuttling SR-like mRNA binding protein implicated in many steps of mRNA biogenesis, including splicing and export, and Mtr10 is its karyopherin (importin). In this work I analyzed both the previously identified and newly generated mutants, and showed that both mtr10 and npl3 suppressors of the defective splicing disrupt nucleocytoplasmic shuttling of Npl3. This results in reduced nuclear Npl3 levels and improved splicing of mutant, suboptimal introns. Interestingly, alterations of nuclear export also improve splicing of suboptimal introns. I propose that the observed splicing effects result from two mechanisms. First, destabilization of Npl3-Mtr10 interactions leads to inefficient re-import of Npl3 to the nucleus. Second, defective interactions of Npl3 with the export machinery inhibit RNA transport to the cytoplasm. Both these mechanisms give more time for the spliceosome to assemble on suboptimal substrates, thus allowing for the completion of splicing before RNA export to the cytoplasm. Notably, RNA sequencing analyses of the selected suppressor strains suggest that increased usage of cryptic splice sites caused by e.g., npl3 mutants is counterbalanced by a general inhibition of splicing due to limiting levels of certain spliceosomal components (e.g., of Prp5 splicing factor). Additionally, non-canonical/non-physiological splicing signals, used more frequently in the mutant strains, may sequester spliceosomal proteins from canonical introns, leading to the observed general decrease of splicing efficiency. Together, my results indicate that reduction of nuclear Npl3 levels leads to a decreased stringency of splice site selection, uncovering a previously unknown role of Npl3 in the modulation of splicing specificity. Thus, Npl3 acts by analogy to eukaryotic SR proteins that modulate alternative splicing patterns.