Modyfikacje syntezy i wydzielania triterpenoidów w kulturze korzeni włośnikowatych nagietka lekarskiego Calendula officinalis wywołane przez elicytory biotyczne

Triterpenoidy są zróżnicowaną grupą związków roślinnych pełniących istotne funkcje w metabolizmie pierwotnym i wtórnym. Różnorodne aktywności biologiczne i właściwości farmakologiczne czynią te substancje wartościowymi z punktu widzenia biotechnologii. Roślinne kultury in vitro są wykorzystywane do biotechnologicznej produkcji cennych substancji, mogą także stanowić dogodny model eksperymentalny do badań metabolicznych. Korzenie włośnikowate są rodzajem kultur korzeniowych otrzymywanych przez transformację tkanki roślinnej bakterią Agrobacterium rhizogenes. Cechują się stabilnością genetyczną, szybkim wzrostem i zdolnością do syntezy metabolitów obecnych w roślinach macierzystych, co sprawia, że mogą być wykorzystywane zarówno w badaniach biochemicznych, jak i w produkcji biotechnologicznej. Elicytacja jest metodą służącą do zwiększenia produktywności kultur in vitro przez działanie substancji lub czynników mogących stymulować syntezę pożądanych metabolitów. W obecnej pracy zbadano wpływ wybranych elicytorów biotycznych na biosyntezę triterpenoidów i steroidów w kulturach korzeni włośnikowatych nagietka lekarskiego Calendula officinalis. Zastosowano substancje należące do grupy regulatorów wzrostu i rozwoju (hormonów roślinnych): kwas jasmonowy, kwas salicylowy, kwas abscysynowy i etylen (kwas 2-chloroetylofosfonowy) oraz ekstrakt drożdżowy należący do grupy elicytorów biotycznych złożonych. Działanie testowanych substancji opiera się na symulowaniu ataku roślinożercy, infekcji patogenem lub naturalnej reakcji rośliny na bodziec hormonalny, co w efekcie może prowadzić do indukcji zmian metabolicznych i stymulacji syntezy związków obronnych. Wśród badanych substancji najbardziej efektywnym elicytorem okazał się kwas jasmonowy, który zwiększył nie tylko zawartość wolnego kwasu oleanolowego i jego glikozydów w korzeniach włośnikowatych (odpowiednio 52- i 36-krotnie), ale jednocześnie także 193-krotnie wydzielanie saponin do pożywki, co jest najwyższym wskaźnikiem elicytacji odnotowanym w literaturze naukowej. Wydajnym elicytorem syntezy i wydzielania saponin kwasu oleanolowego okazał się również kwas abscysynowy, który już po pięciu dniach inkubacji zwiększył o 80% zawartość wolnego kwasu oleanolowego w korzeniach oraz 6,6-krotnie wydzielanie saponin do pożywki. Etylen i kwas salicylowy nie wpłynęły w istotny sposób na biosyntezę triterpenoidów, natomiast wywołały znaczącą stymulację biosyntezy steroidów (zwłaszcza stigmasterolu). Ekstrakt drożdżowy okazał się nieskutecznym elicytorem zarówno w stosunku do biosyntezy triterpenoidów, jak i steroidów. Przy bardzo intensywnej stymulacji biosyntezy triterpenoidów, wywołanej elicytacją kwasem jasmonowym i abscysynowym, zaobserwowano zachodzenie konkurencyjności szlaków metabolizmu pierwotnego i wtórnego, czyli biosyntezy steroidów i triterpenoidów pentacyklicznych. Natomiast elicytacja kwasem salicylowym i etylenem spowodowała modyfikacje szlaku biosyntezy steroli, prowadzące do przebudowy profilu ilościowego tych związków, zwłaszcza proporcji stigmasterol: sitosterol. Brak istotnego wpływu ekstraktu drożdżowego na syntezę triterpenoidów i jednoczesne zahamowanie syntezy steroli sugeruje istnienie innego mechanizmu odpowiedzi na elicytory grzybowe, nie związanego z metabolizmem badanych grup związków. Badania przeprowadzone w ramach tej dysertacji dostarczyły nowych danych na temat możliwości zwiększenia syntezy i wydzielania triterpenoidów w kulturach in vitro, co może mieć praktyczny wymiar biotechnologiczny, oraz pozwoliły zaobserwować istotne modyfikacje metabolizmu triterpenoidów i steroidów zachodzące pod wpływem elicytorów biotycznych, mogące być przejawem metabolicznych konsekwencji stresu biotycznego.

Triterpenoids constitute a diverse group of plant natural compounds playing substancial functions in primary and secondary metabolism. Due to various biological activities and pharmacological properties, these compounds are highly valued in biotechnology. Plant in vitro cultures are applied in biotechnological production of valuable substances, they also can serve as a suitable experimental model for metabolic research. Hairy roots are a type of root cultures formed by transformation of plant tissue with a bacterium Agrobacterium rhizogenes. Important features of root cultures are a genetic stability, a fast growth and an ability to synthesise of metabolites occurring in native plants, which enables their application both in biochemical research and in biotechnological production. Elicitation is a method for increasing the productivity of in vitro cultures by application of external substances or factors to stimulate the synthesis of desired compounds. In the present study, the influence of selected biotic elicitors on triterpenoid and steroid biosynthesis in hairy root cultures of marigold Calendula officinalis was investigated. Jasmonic acid, salicylic acid, abscisic acid and ethylene (chloroethylphosphonic acid) classified as plant growth and development regulators, and the yeast extract belonging to biotic elicitors with complex composition, were applied. The action of tested elicitors is mimicing the herbivorous attack, patogen infection or natural reaction of the plant for hormonal stimulus, what can lead to the induction of metabolic changes and stimulation of the synthesis of defense compounds. Among all elicitors applied in the present study, jasmonic acid appeared the most efficient, increasing not only the content of free oleanolic acid and its glycosides in hairy root tissues (52-fold and 36-fold, respectively), but simultaneously also the saponin secretion to the medium (193-fold), what is the highest enhancement achieved as a result of elicitation reported in scientific literature. Abscisic acid also appeared the efficient elicitor of synthesis and secretion of oleanolic acid saponins, increasing by 80% the content of oleanolic acid in hairy roots, and saponin secretion to the medium by 6.6-fold after 5 days of incubation. Ethylene and salicylic acid did not influence significantly triterpenoid biosynthesis, whereas they markedly stimulated steroid biosynthesis (particularly stigmasterol). Yeast extract was inefficient both for triteprenoid and steroid biosynthesis. During the very intense stimulation of triterpenoid biosynthesis, triggered by elicitation with jasmonic and abscisic acids, the competition of the pathways of primary and secondary metabolism, i.e. the biosynthesis of steroids and pentacyclic triterpenoids, was observed. Elicitation with the use of salicylic acid and ethylene leaded to the modifications of sterol biosynthesis including the rearrangement of quantitative profile of these compounds, particularly the ratio stigmasterol: sitosterol. In turn, the lack of significant effect exerted by the yeast extract on triterpenoid biosynthesis, and simultaneous inhibition of sterol synthesis points out to the existence of another mechanism of defense reaction to fungal elicitors, not connected to the metabolism of the studied compounds. The investigation conducted in the frame of this disertation provided the new data on the possibility of the enhancement of biosynthesis and secretion of triterpenoids in plant in vitro cultures, what can have practical biotechnological application, and allowed to observe the important modifications of triterpenoid and steroid metabolism triggered by biotic elicitors, that can help to understand the metabolic consequences of biotic stress in plants.