Identyfikacja molekularna oraz charakterystyka biochemiczna dehydrogenazy L-fukozowej ssaków

W naturze L-fukoza jest głównym enancjomerem fukozy oraz jedynym monosacharydem w konfiguracji L, wykorzystywanym przez organizmy ssaków [Schneider i wsp., 2017]. Cukier ten uczestniczy w reakcjach glikozylacji (fukozylacji) białek i lipidów komórkowych, pełniąc ważne role w wielu procesach biochemicznych. Aktywną formą L fukozy jest GDP-L-fukoza, która powstaje w komórkach z GDP-mannozy (tzw. „szlak de novo”), a także z L-fukozy pobranej z przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub uwolnionej z glikanów degradowanych w lizosomach („szlak odzysku”) [Yurchenco i Atkinson,1975]. Ponadto, w komórkach wątroby oraz nerek ssaków, L-fukoza ulega degradacji do L-mleczanu oraz pirogronianu w szlaku katabolicznym, którego rola fizjologiczna pozostaje nieznana. Enzymy tego szlaku częściowo oczyszczono i wstępnie scharakteryzowano w drugiej połowie ubiegłego wieku [Schachter i wsp., 1969; Endo i Hiyama, 1979], jednak ich tożsamość molekularna i właściwości biochemiczne pozostają w dużej mierze nieznane. W niniejszej pracy doktorskiej zidentyfikowano molekularnie pierwszy enzym szlaku degradacji L-fukozy u ssaków - dehydrogenazę L-fukozową oraz wykonano jego dokładną charakterystykę biochemiczną [Witecka i wsp., 2024]. Dehydrogenazę L-fukozową oczyszczono ≈340-krotnie z wątroby królika w sześcioetapowym procesie, obejmującym m.in. frakcjonowanie z użyciem glikolu polietylenowego (PEG 4000), chromatografię anionowymienną, wysalanie chlorkiem sodu, filtrację żelową oraz chromatografię powinowactwa. Wykorzystując chromatografię cieczową sprzężoną z tandemową spektrometrią mas (LC-Q-ToF) zidentyfikowano białka obecne w oczyszczonym preparacie enzymu. Analiza uzyskanych wyników pozwoliła wytypować dehydrogenazę 17-β-hydroksysteroidową typu 14 (HSD17B14) jako potencjalną dehydrogenazę L-fukozową. W celu zweryfikowania tej hipotezy, w ludzkich komórkach HEK293T wytworzono rekombinowane białko HSD17B14 królika (rbHSD17B14), zawierające w N-końcowej części metkę histydynową (His6-tag). Rekombinowany enzym oczyszczono techniką FPLC, wykorzystując chromatografię powinowactwa na złożu niklowym, a jego aktywność potwierdzono w teście spektrofotometrycznym. Uzyskano także zmutowaną formę badanego enzymu, w której kluczową dla katalizy resztę tyrozynową zamieniono na resztę fenyloalaninową (Y154F) [Badran i wsp., 2019], co skutkowało utratą badanej aktywności enzymatycznej. W kolejnym etapie badań wytworzono rekombinowane enzymy człowieka (hHSD17B14) oraz szczura (rHSD17B14) w bakteryjnym systemie ekspresyjnym. Wszystkie rekombinowane enzymy scharakteryzowano biochemicznie, wyznaczając ich swoistość substratową, optimum pH oraz parametry kinetyczne katalizowanych reakcji. Wyniki testów swoistości substratowej potwierdziły, że L-fukoza jest preferowanym substratem badanych enzymów. Natomiast β-estradiol, który dotychczas uważano za fizjologiczny substrat HSD17B14 [Lukacik i wsp., 2007], nie jest wykorzystywany efektywnie. We współpracy z laboratorium spektroskopii NMR, Centrum Nauk Biologiczno-Chemicznych Uniwersytetu Warszawskiego wykonano także identyfikację produktu reakcji katalizowanej przez białko HSD17B14 człowieka. Wykazano, że badany enzym utleniania L-fukozę do niestabilnego L-fukono-1,5-laktonu, który w warunkach reakcji spontanicznie przekształca się do L-fukono-1,4-laktonu, lecz nie do L-fukonianu jak dotychczas sądzono. Ponadto potwierdzono, że komórki ludzkiej linii Caco-2 endogennie wyrażają białko HSD17B14 oraz utleniają L-fukozę do L-fukonianu in vitro. Dehydrogenaza L-fukozowa jest enzymem rozpoczynającym szlak degradacji L fukozy u ssaków. Udowodnienie, że białko HSD17B14 warunkuje badaną aktywność enzymatyczną, jest więc ważnym krokiem na drodze do pełnego opisania szlaku degradacji L fukozy u ssaków oraz zrozumienia jego roli fizjologicznej. W dalszej perspektywie wyniki przeprowadzonych badań mogą przyczynić się do poznania schorzeń człowieka wynikających z zaburzeń w szlaku degradacji L- fukozy.

In nature, L-fucose is the main enantiomer of fucose, and the only monosaccharide in the "L" configuration, that is used by mammalian organisms [Schneider et al., 2017]. The sugar is involved in glycosylation (fucosylation) of cellular proteins and lipids and plays important roles in various biochemical processes. The active intracellular form of L-fucose is GDP-L-fucose which is formed from GDP-mannose ("de novo" pathway). Alternatively, GDP-L-fucose can be synthetized from L-fucose which comes from the extracellular milieu or is released from glycans degraded in lysosomes (the "salvage pathway") [Yurchenco and Atkinson, 1975]. In the liver and kidneys of mammals, L-fucose is also broken down to L lactate and pyruvate in a catabolic pathway, whose physiological role remains unknown. The enzymes of this pathway were partially purified and characterized in the second half of the last century [Schachter et al., 1969; Endo and Hiyama, 1979], but their molecular identity and biochemical properties remain unknown. In this doctoral thesis, L-fucose dehydrogenase, the first enzyme of the L-fucose degradation pathway in mammals, was molecularly identified, and biochemically characterized [Witecka et al., 2024]. L-fucose dehydrogenase was purified 340 times from rabbit liver in a six-step process, including polyethylene glycol fractionation (PEG 4000), anion exchange chromatography, salting with sodium chloride, gel filtration and affinity chromatography. The proteins present in the purified enzyme preparation were then identified using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-Q-ToF). Analysis of the obtained data allowed me to select 17-β-hydroxysteroid dehydrogenase type 14 (HSD17B14) as the best candidate for L fucose dehydrogenase. To verify this hypothesis, recombinant rabbit HSD17B14 protein (rbHSD17B14) in a fusion with N-terminal histidine-tag (His6-tag) was produced in human HEK293T cells. The recombinant enzyme was purified by FPLC using nickel affinity chromatography, and its activity was confirmed spectrophotometrically. A mutated form of the enzyme was also produced, in which a catalytic tyrosine residue was replaced with a phenylalanine residue (Y154F) [Badran et al., 2019]. This substitution resulted in the loss of the enzyme activity. Next, recombinant human (hHSD17B14) and rat (rHSD17B14) enzymes were produced in a bacterial expression system. All recombinant enzymes were biochemically characterized, including determination of their substrate specificity, optimal pH, and kinetic parameters. The results of the substrate specificity tests confirmed that L-fucose is the preferred substrate of the tested enzymes, whereas β-estradiol, which has been considered a physiological substrate of HSD17B14 [Lukacik et al., 2007], is not used effectively. In cooperation with the NMR spectroscopy laboratory (the Biological and Chemical Sciences Center, University of Warsaw), the identity of the product of the reaction catalyzed by the human HSD17B14 protein was also verified. It was shown that the enzyme studied oxidizes L-fucose to an unstable L-fucono-1,5-lactone, which spontaneously transforms into L-fucono 1,4-lactone, and not into L-fuconate as previously thought. Moreover, human Caco-2 cells were shown to express the HSD17B14 protein endogenously and oxidize L-fucose to L fuconate in vitro. L-fucose dehydrogenase is an enzyme that initiates the L-fucose degradation pathway in mammals. By showing that the HSD17B14 protein is L-fucose dehydrogenase, I make the first step towards fully describing the L-fucose degradation pathway in mammals and understanding its physiological role. The results of these studies may help identify human diseases resulting from disorders in the L-fucose degradation pathway.