Rola oddziaływań międzykomórkowych z udziałem ścieżki sygnalizacyjnej Fgf4/Erk oraz apoptozy w regulacji rozwoju chimerowego zarodka myszy

Przedimplantacyjny zarodek myszy (i innych ssaków) cechuje się niezwykłymi zdolnościami regulacyjnymi. Jednym z przejawów tej plastyczności jest możliwość uzyskania osobników chimerowych z wykorzystaniem komórek ES. Pomimo wielu lat badań mechanizmy leżące u podstaw niezwykłej plastyczności zarodka ssaka nie są w pełni poznane. Celem niniejszej rozprawy była zatem próba pogłębienia wiedzy na temat mechanizmów odpowiedzialnych za regulacyjny charakter embriogenezy przedimplantacyjnego zarodka myszy, ze szczególnym uwzględnieniem szlaku FGF4/ERK oraz zjawiska apoptozy. Narzędziem w moich badaniach był chimerowy zarodek myszy powstały w wyniku iniekcji komórek ES do zarodka w stadium 8-komórkowym. W CZĘŚCI 1. doświadczeń badając wpływ aktywacji ścieżki FGF4/ERK na różnicowanie komórek ES oraz tworzonych z ich udziałem chimerowych zarodków myszy wykazałam, iż FGF4 w chimerach kieruje wszystkie komórki ICM zarodka gospodarza na drogę różnicowania w PE, zwiększając do 100% wydajność uzyskiwania blastocyst, których EPI budują wyłącznie komórki ES, a w konsekwencji – osobników „czystych”. Formowanie chimer na drodze iniekcji zmodyfikowanych genetycznie komórek ES jest jednym z etapów procedury pozwalającej na uzyskanie zwierząt transgenicznych, które są powszechnie wykorzystywane jako model m.in. w badaniach nad funkcją genów oraz w rozwoju metod leczenia chorób o podłożu genetycznym. Metoda ta jest jednak długotrwała i mało wydajna. Możliwość sterowania losem komórek w zarodku, do którego wprowadzono komórki ES, poprzez modulację poziomu FGF4 w pożywce hodowlanej, mogłoby przyczynić się do optymalizacji tej procedury. W CZĘŚCI 2. pracy badając wpływ inhibicji szlaku FGF4/ERK na rozwój chimerowego zarodka, wykazałam, że częściowa (uzyskana na skutek obecności w zarodku komórek ES Fgf4-/-) lub całkowita inhibicja ścieżki FGF/ERK w chimerowym zarodku myszy zaburza odpowiednio częściowo lub całkowicie powstawanie linii PE. Dowiodłam ponadto, iż za specyfikację PE oraz ustalenie prawidłowych proporcji komórek PE:EPI w przedimplantacyjnym, chimerowym zarodku myszy odpowiadają parakrynowe oddziaływania między komórkami ES a blastomerami zarodka, w których uczestniczy szlak FGF4/ERK. W CZĘŚCI 3. badań weryfikując, przy użyciu techniki filmowania poklatkowego, czy obecność komórek ES w chimerowym zarodku myszy wpływa na wzór cytokinezy i długość cyklu komórkowego budujących go blastomerów wykazałam, iż w zarodkach zawierających komórki ES dochodzi do wzrostu częstości podziałów symetrycznych podczas 4. tury podziałów bruzdkowania, w wyniku czego generowana jest większa liczba blastomerów zewnętrznych. W zarodkach takich, pod wpływem obecnych w nich komórek ES, dochodzi również do wydłużenia cyklu komórkowego podczas 5. rundy podziałów bruzdkowania. W CZĘŚCI 4. rozprawy weryfikując czy wprowadzone do zarodka komórki ES lub czynniki wydzielane przez te komórki indukują w blastomerach zarodka selektywny proces programowanej śmierci wykazałam, że zjawisko wybiórczej apoptozy blastomerów zachodzi częściej w linii ICM niż TE, jednak nie zależy ono od obecności w zarodku komórek ES, ani obecności w środowisku zewnętrznym zarodka czynników wydzielanych przez te komórki, a jest częścią naturalnego procesu dojrzewania blastocysty.

The pre-implantation embryo of mice (and other mammals) holds remarkable regulatory abilities. One of the many manifestations of this plasticity is the possibility of obtaining chimeric individuals using ESCs. Despite many years of research the mechanisms underlying the extraordinary plasticity of the mammalian embryo are not fully understood. The aim of this dissertation was therefore an attempt to deepen the knowledge of the mechanisms responsible for the regulatory nature of embryogenesis of the pre-implantation mouse embryo, with a particular emphasis on the FGF4/ERK pathway and the phenomenon of apoptosis. As a tool in my research, I used chimeric mouse embryos resulting from the injection of ESCs into the 8-cell stage embryos. In the first part of the experiments, by examining the effect of activation of the FGF4/ERK pathway on the differentiation of ESCs and chimeric mouse embryos created using ESCs, I showed that FGF4 in chimeras directs all ICM cells of the host embryo to the PrE fate, thus increasing the efficiency of obtaining blastocysts whose EPIs are built exclusively by ESCs, and consequently - of "pure" individuals up to 100%. The formation of chimeras using genetically modified ESCs constitutes one of the stages of the procedure that allows obtaining transgenic animals, which are commonly used as models in research on gene function and the development of gene therapies. However, this method is lengthy and inefficient. The ability to control cell fate in an embryo containing ESCs by modulating the level of FGF4 in the culture medium could contribute to optimizing this procedure. In the second part of the thesis, by examining the effect of partial and complete inhibition of the FGF4/ERK cascade on the development of a chimeric mouse embryo I showed that partial (resulting from the presence of Fgf4-/- ESCs in the embryo) and complete inhibition of the FGF4/ERK pathway in a chimeric mouse embryo disrupts the formation of the PrE lineage partially or entirely, respectively. I also proved that the specification of PrE and establishment of the correct ratio of PrE:EPI cells in the pre-implantation chimeric mouse embryos are due to paracrine interactions between ESCs and the blastomeres of the host embryo, mediated by the FGF4/ERK pathway. In the third part of my research, by verifying with the time-lapse imaging technique, whether the presence of ESCs in the chimeric mouse embryo affects the cytokinesis pattern and the length of the cell cycle of the host blastomeres, I showed that chimeric embryos increase the frequency of symmetric divisions during the 4th round of cleavage divisions and, as a result, generate a higher number of outer blastomeres. Moreover, embryos containing ESCs lengthen their cell cycle during the 5th round of cleavage divisions. In the fourth part of my dissertation, by verifying whether ESCs introduced into the embryo or factors secreted by these cells induce a selective process of programmed death in the host blastomeres, I showed that the phenomenon of selective blastomere apoptosis occurs more often in the ICM than TE lineage. This phenomenon, however, does not depend on the presence of ESCs in the host embryo, nor the presence of factors secreted by these cells. It rather constitutes a part of the natural process of blastocyst maturation.