Degradacja RNA w mitochondriach człowieka

Przez wiele lat enzymy odpowiedzialne za proces degradacji mitochondrialnego RNA (mtRNA) człowieka pozostawały nieznane. Badania, w których uczestniczyłem, pozwoliły nam jako pierwszym wykazać, że RNA/DNA helikaza hSuv3 jest niezbędna dla prawidłowej degradacji mtRNA. Był to pierwszy enzym, dla którego wykazano bezpośrednie zaangażowanie w ten proces. W komórkach pozbawionych aktywności hSuv3 (za pomocą siRNA lub poprzez ekspresję katalitycznie nieaktywnego białka) akumulują się produkty pośrednie degradacji mtRNA oraz duże ilości niekodujących transkryptów, komplementarnych do mt-mRNA, które nazwaliśmy mirror-RNA. Stabilizacji ulega również zbadany mt-mRNA. Dalsze badania miały na celu identyfikację molekularnego partnera helikazy hSuv3, który posiadałby aktywność rybonukleolityczną. Uzyskane przez nas wyniki sugerowały, że fosforylaza polinukleotydowa (PNPaza), enzym zdolny do fosforolitycznej degradacji RNA, może być poszukiwaną RNazą. Wiele ośrodków badawczych sugerowało, że PNPaza nie może pełnić tej roli, ponieważ lokalizuje się w przestrzeni międzybłonowej i reguluje import RNA do mitochondriów. Przeprowadzone przeze mnie badania wykazały, że część PNPazy jest również obecna w macierzy mitochondrialnej. Obniżenie poziomu tego białka prowadzi do akumulacji produktów pośrednich degradacji mtRNA i stabilizuje transkrypty mitochondrialne. Wykazałem, że PNPaza w procesie degradacji mtRNA współdziała z helikazą hSuv3, z którą tworzy kompleks in vivo – ludzki degradosom mitochondrialny. Kompleks ten powstaje tylko w określonych miejscach mitochondriów w postaci skupisk, ognisk, które nazwaliśmy D-foci. Odkrycie D-foci było możliwe dzięki zastosowaniu przeze mnie technik mikroskopowych dotychczas niestosowanych w badaniach białek mitochondrialnych u człowieka (BiFC oraz FLIM-FRET). Przeprowadzone przeze mnie badania dostarczyły decydujących dowodów na: 1) identyfikację ludzkiej mitochondrialnej RNazy odpowiedzialnej za degradację mtRNA, którą okazała się być PNPaza, 2) odkrycie nieznanych dotychczas struktur związanych z metabolizmem mtRNA (D-foci), 3) stwierdzenie, że proces degradacji mtRNA jest zorganizowany przestrzennie i zależy od formowania kompleksu PNPaza-hSuv3, 4) rozstrzygnięcie długoletniej debaty odbywającej się w środowisku naukowym na temat bezpośredniego udziału PNPazy w metabolizmie mtRNA.

For many years, the enzymes responsible for degradation of human mitochondrial RNA (mtRNA) were not known. We were the first to show that the RNA/DNA helicase hSuv3 is essential for proper mtRNA degradation. It was the first enzyme shown to be directly involved in this process. In cells lacking hSuv3 activity (using siRNA or by expression of a catalytically inactive protein) we observed accumulation of mtRNA degradation intermediates and large amounts of non-coding transcripts complementary to the mt-mRNAs, which we called mirror-RNA. mt-mRNA was also stabilized. Further studies were aimed at identification of the molecular partner of hSuv3 helicase, which would have ribonucleolytic activity. Our results suggested that polynucleotide phosphorylase (PNPase), an enzyme capable of phosphorolytic RNA degradation, could be the sought RNase. Many research groups have suggested that PNPase cannot play this role because it is localized in the intermembrane space and regulates RNA import into mitochondria. However, I showed that a fraction of PNPase is also present in the mitochondrial matrix. Reducing the level of PNPase leads to the accumulation of partially degraded mtRNAs and stabilizes mitochondrial transcripts. I showed that PNPase cooperates with the helicase hSuv3 in mtRNA decay, these proteins form a complex in vivo - the human mitochondrial degradosome. The complex is formed only in certain areas of mitochondria observed as distinct foci, which we called D-foci. The discovery of D-foci was made using microscopic techniques not previously used in studies of mitochondrial proteins in humans (BiFC and FLIM-FRET). The results of my studies provided conclusive evidence for: 1) the identification of human mitochondrial RNase responsible for the degradation of mtRNA, which turned out to be PNPase, 2) the discovery of previously unreported structures related to mtRNA metabolism (D-foci), 3) determining that PNPase-hSuv3 dependent mtRNA degradation is spatially organized and depends on the PNPase-hSuv3 complex formation, 4) the clarification of the long-debated issue about the direct involvement of PNPase in mtRNA metabolism.