Distribution, genetic identity and zoonotic reservoir of Diroflaria spp., the causative agents of human and canine diroflariasis

Dirofilarioza to szybko rozprzestrzeniająca się choroba psów, a czasami także innych mięsożernych zwierząt i ludzi. Różne gatunki komarów mogą odgrywać rolę wektorów filarii. Wiele czynników przyczynia się do rozprzestrzeniania się nicieni, w tym zmiany klimatyczne, które ułatwiają rozwój i przeżycie Dirofilaria repens i Dirofilaria immitis w komarach. Przemieszczenie zarażonych żywicieli ostatecznych (psów) z regionów endemicznych do regionów nieendemicznych jest inną możliwą przyczyną lokalnego pojawienia się choroby, a obecność dzikich zwierząt stanowiących rezerwuar pasożyta może również przyczynić się do jego rozprzestrzeniania się. Głównym celem moich badań było: 1) Określenie rozpowszechnienia zarażenia D. repens w hodowlach psów zaprzęgowych na krajach bałtyckich i innych krajach w regionie; 2) Analiza czynników wpływających na rozpowszechnienie zarażenia D. repens u psów; 3) Porównanie rozpowszechnienia D. repens u psów domowych i dzikich mięsożernych; 4) Ocenienie rozpowszechnienia D. immitis u psów zaprzęgowych na krajach bałtyckich i w Polsce; 5) Określenie rozpowszechnienia D. repens u różnych gatunków dzikich mięsożernych w różnych regionach Polski; 6) Charakteryzacja zmienności genetycznej D. repens i D. immitis na obszarze Europy Południowej, Środkowej, Wschodniej i Pólnocno-Wschodniej, a także izolatów z Bliskiego Wschodu i południowej Azji; 7) Identyfikacja najbardziej ekspansywnych i najczęstszych genotypów/haplotypów zarówno D. repens, jak i D. immitis; 8) Porównanie różnorodności genetycznej między D. repens a D. immitis. Aby osiągnąć te cele, przeprowadzono wielostronne badania terenowe i laboratoryjne. Badania terenowe obejmowały pobieranie prób krwi od psów z różnych krajów, dokumentowanie historii przypadków każdego zwierzęcia, testowanie psów przy użyciu testu IDEXX SNAP do wykrywania antygenów D. immtis, zbieranie padłych dzikich mięsożernych. Praca laboratoryjna obejmowała sekcje zwierząt, ekstrakcję DNA z prób krwi i dorosłych pasożytów, selekcję markerowych genów mitochondrialnych, projektowanie starterów, testy PCR, sekwencjonowanie produktów reakcji PCR, genetykę populacyjną i analizę statystyczną oraz analizę filogenetyczną. Alsarraf et al. (Scientific Reports 2021): W latach 2017-2019 zebrano 424 próby krwi od psów z ośmiu krajów, w tym 227 próbek od psów zaprzęgowych i 197 próbek od innych psów. DNA D. repens wykryto u 59 z 424 psów (ekstensywność 13.9%). D. repens wykryto u psów zaprzęgowych z Litwy, Łotwy, Polski i Białorusi. Tylko jeden pies z Estonii był zarażony, prawdopodobnie przypadek importowany z Litwy. Najwyższą ekstensywność zarażenia odnotowano na Litwie (38%). Wśród psów domowych z Ukrainy sześć psów uzyskało wynik pozytywny (3.8%). Nasze badanie wykazało wysoką ekstensywność zarażenia D. repens na Litwie i Łotwie, ale brak dowodów na rozprzestrzenianie się D. immitis. Alsarraf et al. (Parasitology Research 2023): Techniki molekularne zostały użyte do zbadania 511 próbek krwi i śledzion od siedmiu gatunków dzikich mięsożernych (wilków, lisów, borsuków, szopów, jenotów, kun domowych i leśnych) z różnych regionów Polski. Zarażenia D. repens zidentyfikowano w 7/14 województwach w 4/7 regionach Polski: na Mazowszu, w Małopolsce, na Pomorzu i Warmia-Mazury. Najwyższą ekstensywność zarażenia odnotowano w regionie Mazowsza (8%), pokrywającą się z najwyższą dotychczas zarejestrowaną ekstensywnością zarażenia u psów (12-50%) w Polsce Środkowej. DNA D. repens wykryto w 16 próbkach trzech gatunków (łączne rozpowszechnienie 3.13%). Niski i podobny odsetek pozytywnych prób (1,9%, 4,2% i 4,8%) odnotowano odpowiednio wśród borsuków, lisów i wilków. Alsarraf et al. (Veterinary Parasitology 2023): Zróżnicowanie genetyczne D. repens określono na 95 izolatach z Europy Środkowej i Wschodniej (Polska, Białoruś, Ukraina, Austria, Rumunia), Europy Pólnocno-Wschodniej (Litwa, Łotwa, Estonia), z Włochy i Izraela. Zidentyfikowano 18 haplotypów D. repens (DR1-DR18) na podstawie połączonych sekwencji markerów mitochondrialnych (mtDNA) (COI+NADH) wśród 95 analizowanych próbek. Haplotyp DR1 był najbardziej rozpowszechniony, obejmując 66 izolatów: 42 izolaty z Polski (41 od psów i jeden od człowieka), 13 z Litwy, 4 z Łotwy, 2 z Ukrainy i 5 z Rumunii. Wszystkie pozostałe haplotypy grupowały się wokół haplotypu DR1, oddzielone od niego o 1-5 SNP, tworząc kształt gwiazdy. Haplotyp DR2 był drugim najczęściej występującym haplotypem, utworzonym przez sześć izolatów z Rumunii. Co ciekawe, haplotyp DR3 był reprezentowany tylko przez cztery izolaty z Izraela. Pozostałe 15 haplotypów reprezentowane było przez 1-4 izolaty z różnych źródeł. Z kolei analiza markera genomowego, ITS-1 rDNA pokazała, że wśród 49 testowanych sekwencji wyróżniono tylko dwa haplotypy (A i B), które różniły się obecnością/brakiem motywu "AAT". Alsarraf et al. (Parasites & Vectors 2023): Dirofilaria repens wykazała wyższe zróżnicowanie genetyczne niż Dirofilaria immitis. Analiza Median Spanning Network oparta na połączonej sekwencji (1 721 pz) dwóch markerów mitochondrialnych (COI+NADH) pozwoliła wyróżnić dziewięć haplotypów (Di1-Di9) D. immitis. Haplotyp Di1 był dominującym haplotypem (91 z 122 sekwencji), występującym w 9 krajach i u 4 gatunków żywicieli. Haplotyp Di2 był drugim najczęstszym haplotypem, utworzonym wyłącznie przez 13 izolatów z Włoch. Pozostałe sekwencje przypisano haplotypom Di3-Di9, różniącym się o 1-4 SNP od dominującego haplotypu Di1. Istnieją dowody na geograficzną segregację haplotypów, przy czym trzy unikalne haplotypy były związane z Włochami, a cztery inne związane z określonymi krajami (Di4 i Di7 ze Słowacją; Di8 z Grecją; Di6 z Węgrami). Podsumowując: • Hodowle psów zaprzęgowych stanowią miejsca o dużym ryzyku transmisji D. repens, w których stwierdzono wysoką ekstensywność zarażenia pasożytem (13.9%). • Przemieszczenie i import psów mogą wpływać na rozpowszechnienie D. repens. • Przeprowadziliśmy pierwsze kompleksowe badanie epidemiologii D. repens u siedmiu gatunków dzikich żywicieli we wszystkich siedmiu regionach Polski i zidentyfikowaliśmy pierwszy przypadek zakażenia D. repens u borsuków europejskich w Polsce i drugi w Europie. • Dirofilaria immitis nadal nie została znaleziona w Polsce i krajach bałtyckich. • Tylko niewielkie zróżnicowanie genetyczne stwierdzono w D. repens, ponieważ wszystkie badane izolaty wydają się grupować się wokół haplotypu DR1 z różnicami od 1 do 5 SNP. • Różnorodność genetyczna określona na podstawie markerów mitochondrialnych była o połowę niższa u D. immitis w porównaniu do D. repens (9 haplotypów D. immitis w porównaniu do 18 haplotypów D. repens), co może być związane z wolniejszym rozprzestrzenianiem się D. immitis w Europie Środkowej i Północno-Wschodniej.

Dirofilariasis is a fast-spreading disease of dogs and occasionally of other carnivores and humans. Different species of mosquitoes constitute the main vectors for the parasite. Several factors contribute to its spread, including climate change, which facilitates development and survival of Dirofilaria repens and Dirofilaria immitis in the mosquitos. Movement/relocation of infected definitive hosts (dogs) from endemic regions to non-endemic regions is another possible cause of local emergence and the presence of wild reservoirs of the parasite may also contribute to its spread. The main aims of this study were to: 1) To determine the prevalence of D. repens infection in sled dog kennels from the Baltic countries and other countries in the region; 2) To analyse factors likely to influence prevalence of infection of D. repens in dogs; 3) To compare prevalence of D. repens in pet dogs and wild carnivores; 4) To assess the prevalence of D. immitis in sled dogs in the Baltic countries and in Poland; 5) To estimate the prevalence of D. repens in different species of wild carnivores from different regions in Poland; 6) To characterize the genetic variation in D. repens and D. immitis in the area of southern, central, eastern and NE Europe, in addition to isolates from the Middle East and southern Asia; 7) To identify the most expansive and successful genotypes/haplotypes in both D. repens and D. immitis; 8) To compare the genetic diversity between D. repens and D. immitis. To address these aims, a combination of extensive field and laboratory work was conducted, the field work included collection of blood samples from dogs from different countries, documenting case history of each animal, antigen testing of dogs using the IDEXX SNAP test for the detection of D. immtis, collection of wild carnivore carcasses. The laboratory work included dissection of carcasses, DNA extraction from blood and adult worm samples, mitochondrial gene selection, primer design, PCR testing, amplicon sequencing, population genetics and statistical analysis and phylogenetic analysis. Alsarraf et al. (Scientific Reports 2021): 424 canine blood samples were collected from eight countries in the period 2017–2019, including 227 samples from sled dogs and 197 samples from other dogs. The DNA of D. repens was detected in 59 of 424 dogs (prevalence 13.9%). D. repens was found in sled dogs from Lithuania, Latvia, Poland and Belarus. Only one dog from Estonia was infected, apparently an imported case. The highest prevalence was recorded in Lithuania (38%). Among pet dogs from the Ukraine, six dogs tested positive (3.8%). Our study has revealed a high prevalence of D. repens infections in Lithuania and Latvia, but no evidence for spread of the heartworm D. immitis. Alsarraf et al. (Parasitology Research 2023): molecular techniques were used to test 511 blood and spleen samples from seven species of wild carnivores (wolves, red foxes, Eurasian badgers, raccoons, raccoon dogs, stone martens, and pine martens) from different regions of Poland. D. repens–positive hosts were identified in 7/14 voivodeships in 4/7 regions of Poland: Masovia, Lesser Poland, Pomerania and Warmia-Masuria. The highest prevalence was found in Masovia region (8%), coinciding with the highest previously recorded prevalence in dogs (12–50%) in Central Poland. The DNA of D. repens was detected in 16 samples of three species (total prevalence 3.13%). A low and similar percentage of positive samples (1.9%, 4.2% and 4.8%) was recorded among badgers, red foxes, and wolves, respectively. Alsarraf et al. (Veterinary Parasitology 2023): Genetic diversity of D. repens was determined in 95 isolates from Central and Eastern Europe (Poland, Belarus, Ukraine, Austria, Romania), NE Europe (Lithuania, Latvia, Estonia), Italy and Israel. 18 D. repens haplotypes (DR1-DR18) were identified in combined mtDNA markers (COI+NADH) among the 95 analysed samples. Haplotype DR1 was the most common encompassing 66 isolates: 42 isolates from Poland (41 from dogs and one from a human), 13 from Lithuania, 4 from Latvia, 2 from Ukraine and 5 from Romania. All other haplotypes grouped around haplotype DR1 separated by 1–5 SNPs, forming a star-like shape. Haplotype DR2 was the second most common haplotype, formed by six isolates from Romania. Interestingly, haplotype DR3 was represented only by four isolates from Israel. The remaining 15 haplotypes were represented by 1–4 isolates of different origins. The Median Spanning Network based on the ITS-1 rDNA gene showed that among the 49 tested sequences only two distinct haplotypes were found (A and B), the two haplotypes were differentiated by the deletion of the “AAT” motif. Alsarraf et al. (Parasites & Vectors 2023): Dirofilaria repens has showed higher genetic diversity than Dirofilaria immitis, Median Spanning Network analysis was based on the combined sequence (1,721 bp) of two mt markers (COI+NADH) and delineated nine haplotypes (Di1-Di9) of D. immitis. Haplotype Di1 was the dominant haplotype (91 out of the 122 sequences) from 9 countries and 4 host species. Haplotype Di2 was the second haplotype, formed solely by 13 isolates from Italy. The remaining sequences were assigned to Di3-Di9 haplotypes, differing by 1-4 SNPs from the dominant Di1 haplotype. There was evidence for geographical segregation of haplotypes, with three unique haplotypes associated with Italy, and four others associated with certain countries (Di4 and Di7 with Slovakia; Di8 with Greece; Di6 with Hungary). In conclusion: • Sled dog kennels constitute hot spots for D. repens transmission where high prevalence was observed (13.9%). • Movement and importation of dogs can be a factor of influence of prevalence of D. repens. • We conducted the first comprehensive study on the epidemiology of D. repens in seven species of wild hosts in all seven regions of Poland and identified the first case of D. repens infection in Eurasian badgers in Poland and the second in Europe. • Dirofilaria immitis was still not found in Poland and Baltic countries. • Only minor genetic diversity was found in D. repens since all screened isolates appear to have clustered in or branched out from haplotype DR1 with 1–5 SNP differences. • The genetic diversity appears to be governed by geographic origin since isolates from neighbouring populations (countries) appear to share unique haplotypes while other populations that are geographically distant from individual haplotypes. • Diversity in D. immitis mt haplotypes was lower by half than in D. repens (9 vs 18 haplotypes in D. immitis and D. repens, respectively), which may be associated with the slower expansion of heartworm in Central and NE Europe.