Intermolecular interactions of protonated nucleobases in the crystalline phase

Zasady azotowe nukleotydów to dwupierścieniowe molekuły organiczne o ważnym znaczeniu biologicznym. Są zarówno witalnym elementem cząsteczek tak kluczowych dla organizmów żywych jak DNA i RNA, jak i częścią centrów aktywnych enzymów bądź składnikiem leków. Z tej przyczyny od czasów odkrycia stanowią ważny temat w różnych dziedzinach nauki. Szczególną uwagę poświęca się parom tworzonym przez zasady azotowe – ich formowanie się jest fundamentem poprawnego funkcjonowania komórki. W mojej pracy doktorskiej skupiam się na oddziaływaniach sprotonowanych zasad azotowych nukleotydów w fazie krystalicznej. Wydaje się, ze jest to wąskie zagadnienie, jednak dokładna analiza owych oddziaływań ujawnia coś zgoła odmiennego. Jedna z metod badania zagadnienia parowania się zasad azotowych nukleotydów może być analiza częstości formowania się takich par w różnych środowiskach. Do tej pory różne grupy badawcze wykonały liczne tego typu analizy, podzielić je jednak można było na dwie grupy – analizę par zasad formowanych przez skrystalizowane molekuły RNA, oraz formowanych w wyniku symulacji kwantowomechanicznych. Pierwsza z tych analiz obarczona jest problemami dotykającymi wszystkich struktur krystalicznych makromolekuł, a mianowicie słabą jakością kryształów i w konsekwencji – niską rozdzielczością pomiaru, która bardzo często nie pozwala na lokalizację atomów wodoru. Druga z analiz siłą rzeczy nie jest zaś w stanie uwzględnić wpływy środowiska zewnętrznego na formowanie się pary. W mojej pracy wybrałam trzeci z możliwych kierunków, czyli analizę częstości występowania par zasad azotowych nukleotydów w kryształach małych molekuł organicznych. W ten sposób możliwym było zarówno wiarygodne przyjrzenie się protonacji zasad azotowych jak i ocena wpływu środowiska zewnętrznego na formowanie się pary. Na podstawie wyników widać, że pary występujące często w kryształach małych molekuł często występują także w kryształach RNA. Oprócz obecności podstawnika w miejscu występowania wiązania glikozydowego, protonacja również jest jednym z czynników determinujących to, jaki typ pary zostanie stworzony, a jej wpływ wychodzi daleko poza tworzenie zawady sterycznej bądź umożliwienie formowania wiązania wodorowego. Możliwość tworzenia struktur wyżej rzędowych, a także obecność molekuł towarzyszących w krysztale również miały wpływ na formowanie się par. Podsumowując – udało się znaleźć i wyjaśnić wiele ogólnych trendów charakterystycznych dla wszystkich rozważanych zasad azotowych, ale wiele par stanowiło indywidualne przypadki. W dalszej części skupiłam się na omówieniu serii pomiarów rentgenograficznych struktur zawierających sprotonowaną hipoksantynę – jedną z rzadziej spotykanych zasad azotowych nukleotydów. Rozwiązałam i przeanalizowałam trzy struktury, którym nadałam następujące skróty: Hx1 LT – niskotemperaturowa, zbliźniaczona struktura jednowodnego azotanu hipoksantyny (C5H5N4O+ NO3- H2O, P21/n), Hx1 HT – wysokotemperaturowa struktura jednowodnego azotanu hipoksantyny (C5H5N4O+ NO3- H2O, Pmnb), Hx2 – struktura trójwodnego azotanu hipoksantyny (C5H5N4O+ 2NO3- 2H2O H3O+, P21/n). Hx1 ma charakterystyczną, warstwową strukturę, w której każdy kation hipoksantyny otoczony jest trzema anionami azotanowymi i trzema cząsteczkami wody. Hx2 różni się od obu Hx1 obecnością dodatkowej warstwy molekuł składającej się z jonu oksoniowego i azotanu. Struktura Hx1 wykazała przejście fazowe w niskiej temperaturze połączone z bliźniaczeniem się. Prócz tego struktura Hx1 LT wykazała negatywny współczynnik rozszerzalności termiczne. Oba te fenomeny zostały przedyskutowane w kontekście minimalizowania napięć wewnątrz kryształu związanych ze zmieniającą się temperaturą a w efekcie – przeciwdziałanie rozpadnięciu się całego kryształu. Analiza ta została rozszerzona o obliczenia energii dla ponad stu różnych dimerów obecnych w strukturze, zaś zmiany energii i różne metody użyte do ich otrzymania rzuciły światło na naturę i przyczynę zjawisk zachodzących w ciele stałym.

In my dissertation I focus on the interactions of protonated nucleobases in the crystalline phase. This seems to be a narrow issue, but a careful analysis of these interactions reveals something quite different. One of the methods of studying the problem of base pairing can be the analysis of the frequency of such pairs formation in various environments. So far, many research groups have performed numerous analyzes of this type, and they could be divided into two groups – the analysis of base pairs formed by crystallized RNA molecules and those obtained from quantum mechanical simulations. The first of these analyzes is not free of drawback affecting all the crystal structures of macromolecules, namely poor crystal quality and, consequently, low measurement resolution, which very often does not allow the location of hydrogen atoms. The second of the analyzes cannot take into account the influence of the external environment on the formation of pairs. In my work, I chose the third possible direction, which means the analysis of the frequency of occurrence of nucleobase pairs in crystals of small organic molecules. This way, it was possible both to reliably look at the protonation of bases and to evaluate the influence of the external environment on the formation of said pairs. Basing on the frequencies of base pairs, it can be seen that the pairs often occurring in crystals of small molecules also often occur in RNA crystals. In addition to the presence of a substituent at the site of the glycosidic bond, protonation is also one of the factors that determines what type of pair will be formed, and its effects go well beyond steric clash or possibility of hydrogen bonding due to the presence of an additional proton. The possibility of creating higher-order structures as well as the presence of accompanying molecules in the crystal also influenced the formation of pairs – it was clearly visible in the differences between the energies of nucleobase pairs calculated by other research groups using quantum chemistry methods, and the frequencies of the given pairs in the crystals. In conclusion, I managed to find and explain many general trends characteristic to all the bases considered, but many pairs were individual cases that had to be considered separately. Later in the thesis I focused on discussing a series of X-ray measurements of structures containing protonated hypoxanthine, which is a less frequently occurring nucleobase. I solved and analysed structures of three compounds, which I gave the following abbreviations: Hx1 LT - low-temperature, twinned structure of hypoxanthine nitrate monohydrate (C5H5N4O+ NO3– H2O, P21=n), Hx1 HT - high-temperature, hypoxanthine nitrate monohydrate structure (C5H5N4O+ NO3 – H2O, Pmnb), Hx2 - structure of hypoxanthine nitrate trihydrate (C5H5N4O+ 2NO3– 2H2O H3O+, P21=n). Hx1 has characteristic, layered structure in which each hypoxanthine cation is surrounded by three nitrate anions and three water molecules. Hx2 differs from both Hx1 by the presence of an additional layer of molecules consisting of oxonium ion and nitrate – apart from that the structures were practically identical, distinguished only by minor changes in geometry. The Hx1 structure showed a low temperature phase transition combined with twinning. Moreover, the Hx1 LT structure showed a negative thermal expansion in one direction. Both of these phenomena play a vital role in minimizing the tensions inside the crystal related to the changing temperature, and as a result - preventing the breakdown of the entire crystal. This analysis was extended with dimer energy calculations for more than a hundred different dimers present in the structure, their energy changes and single layer electrostatic potential analysis. I used different methods to obtain these results, which shed light on the nature and cause of discussed phenomena occurring in the investigated crystal.