Zastosowanie funkcjonalizowanych nanostruktur jako nośników dla oksydoreduktaz w układach bioelektrokatalitycznych

Celem prezentowanej rozprawy doktorskiej było zaprojektowanie, scharakteryzowanie i optymalizacja warstw bioelektrokatalitycznych do utleniania glukozy, etanolu lub mleczanu. Prezentowane badania koncentrowały się na doborze funkcjonalizowanych nanomateriałów węglowych i ich zastosowaniu w budowie układów bioelektrokatalitycznych opartych na enzymach oksydoreduktazowych. Integracja nanostruktur węglowych i enzymów (poprzez immobilizację na powierzchni nanostruktur węglowych) powoduje powstanie układów hybrydowych o licznych zastosowaniach w nanotechnologii. Otrzymane warstwy bioelektrokatalityczne można wykorzystać do analizy takich próbek jak: krew, płyny ustrojowe lub produkty spożywcze. Niniejsza praca doktorska dotyczy zastosowania funkcjonalizowanych nanomateriałów, takich jak: wielościenne nanorurki węglowe, elektrochemicznie redukowany tlenek grafenu, grafen czy fulereny (C60/C70) jako nośników dla oksydoreduktaz oraz ich wpływu nie tylko na stałą szybkości przeniesienia elektronu, ale również na parametry elektrochemiczne i kinetyczne układów bioelektrokatalitycznych. Głównym celem było dobranie odpowiedniego nośnika nanowęglowego, który powodowałby przyspieszenie procesu przeniesienia elektronu w układach zawierających enzymy o różnej budowie: dimerycznej, tetramerycznej oraz oktamerycznej. W oparciu o wcześniejsze badania, w celu zwiększenia przewodności elektrycznej i poprawy orientacji białka, nanomateriały modyfikowano niekowalencyjnie kwasem 4-pirol-1-ylo benzoesowym poprzez oddziaływania elektrostatyczne π-π. Metoda ta umożliwiła wprowadzenie na ich powierzchnię karboksylowych grup funkcyjnych (-COOH), które pozwoliły na wytworzenie wiązań kowalencyjnych pomiędzy matrycą a cząsteczkami enzymu, zwiększając trwałość całego układu. Wraz z postępem prac i uzyskanych wyników zaczęto tworzyć układy hybrydowe składające się z dwóch nanostruktur tj. wielościennych nanorurek węglowych oraz elektrochemicznie redukowanego tlenku grafenu. Na tak przygotowanych matrycach scharakteryzowano dwa układy: zawierające oksydazę glukozy (GOx) oraz oksydazę mleczanową (LOx). Następnie, zaczęto zastanawiać się nad alternatywnym sposobem modyfikacji powierzchni nanomateriałów, w celu zwiększenia stałej szybkości przeniesienia elektronu (ks). Doprowadziło to do zaprojektowania i syntezy nowych nanomateriałów: grafenu oraz fulerenów (C60/C70) kowalencyjnie funkcjonalizowanych pochodną kwasu 4-(2-formylo-1H-pirolo) benzoesowego. Spodziewano się, że trwałe połączenie nanostruktur węglowych z czynnikiem modyfikującym wpłynie znacząco na wyznaczane parametry elektrochemiczne oraz kinetyczne. Korzystając z tak przygotowanej matrycy grafenowej (GR@fPyBA) otrzymano trzy osobne układy, w których unieruchomiono enzymy z grupy oksydaz tj: GOx, LOx lub oksydazę alkoholową (AOx). W kolejnej części prezentowanych badań opracowano dwa układy bioelektrokatalityczne oparte na GOx i dwóch różnych pochodnych fulerenu: C60@fPyBA i C70@fPyBA. W wyniku przeprowadzonych badań porównano parametry elektrochemiczne i kinetyczne uzyskane dla wszystkich układów bioelektrokatalitycznych. Skoncentrowano się również na projektowaniu i charakterystyce układów opartych na GR@fPyBA w obecności mediatora redoks – tetratiafulwalenu. Jako element receptorowy wykorzystano oksydazę glukozy oraz oksydazę piranozową (PyOx). W przedstawionej rozprawie doktorskiej przygotowano, zoptymalizowano i scharakteryzowano również układy oparte na NAD (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy)-zależnej dehydrogenazie glukozy unieruchomionej na matrycach GR@fPyBA oraz C70@fPyBA. Uzyskane wyniki badań będą mogły posłużyć do opracowania nowych biosensorów do oznaczania np. glukozy, etanolu czy mleczanów, jak również będą mogły znaleźć zastosowanie przy konstrukcji bioogniw paliwowych.

The aim of presented doctoral dissertation was to design, characterize and optimize bioelectrocatalytic layers for the oxidation of glucose, ethanol or lactate, aimed for potential use in analytical biosensors. Presented studies were focused on the development of appropriate functionalized carbon nanomaterials and their application in the construction of bioelectrocatalytic systems based on oxidoreductase enzymes. Integration of functionalized carbon nanomaterials and enzymes (by immobilization on the surface of carbon nanostructures) results in the formation of hybrid systems with numerous applications in nanotechnology. Obtained bioelectrocatalytic layers can be used for analysis of real samples such as: blood, body fluids or food products. This doctoral dissertation concerns the application of functionalized nanomaterials, such as: multi-walled carbon nanotubes, electrochemically reduced graphene oxide, graphene or fullerenes (C60/C70) and studies on their impact not only on the electron transfer rate constant but also electrochemical and kinetic parameters of prepared bioelectrocatalytic systems. The main goal was to select the nanocarbon matrix, which can improve the electron transfer processes in systems containing enzymes with different structures, including: dimeric, tetrameric and octameric. Based on the previous study, in order to enhance the electric conductivity and protein orientation, nanomaterials were non-covalently modified with 4-pyrrol-1-yl benzoic acid (PyBA) through electrostatic π-π interactions. This method allowed to introduce carboxylic groups on the surface of carbon nanomaterial, which resulted in the formation of covalent bonds with the enzyme molecule and enhanced stability of the system. As the work progressed hybrid systems based on two different carbon nanomaterials i.e.: multi-walled carbon nanotubes and electrochemically reduced graphene oxide were also synthesized. For this part of research two flavin-dependent enzymes: glucose oxidase (GOx) and lactate oxidase (LOx) were used. Thereafter, the alternative way of the surface functionalization was considered and applied in order to increase the electron transfer rate constant (ks) in bioelectrocatalytic systems. This led to the use of graphene (GR) and/or fullerene (C60 /C70), which were covalently functionalized with 4-(2-Formyl-1H-pyrrol-1-yl)benzoic acid (fPyBA). It was expected that covalent functionalization of carbon nanostructures will significantly affect the determined electrochemical and kinetic parameters. Three different systems based on functionalized graphene (GR@fPyBA) were prepared with enzymes such as: GOx, LOx and alcohol oxidase (AOx). In the next part of presented research two bioelectrocatalytic systems based on GOx and two different fullerene derivatives: C60@fPyBA and C70@fPyBA were prepared. Both mentioned above fullerene derivatives were obtained using the modified Prato reaction As a result of performed studies, electrochemical and kinetic parameters obtained for two bioelectrocatalytic systems were compared. The work was also focused on the design and characterization of the bioelectrocatalytic systems based on GR@fPyBA matrix in the presence of mediator (tetrathiafulvalene). For this purpose GOx and pyranose oxidase (PyOx) were used as a bio-recognition elements. Furthermore, in presented doctoral dissertation, the nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)-dependent glucose dehydrogenase (GDH) systems based on GR@fPyBA and C70@fPyBA were prepared, optimized and characterized. The presented research results can be used in development of new biosensors for the determination of e.g. glucose, ethanol or lactate, as well as in the construction of biofuel cells.