Potencjał rozwojowy pojedynczych blastomerów i węzłów zarodkowych przedimplantacyjnych zarodków myszy

W trakcie przedimplantacyjnego rozwoju zarodkowego ssaków blastomery powstające w wyniku podziałów zarodka stopniowo tracą swe potencje rozwojowe, różnicują i tworzą odrębne linie komórkowe: epiblast (EPI), trofektodermę (TE) i pierwotną endodermę (PE), będące prekursorami ciała zarodka oraz struktur pozazarodkowych: łożyska i błon płodowych. Utrata totipotencji blastomerów i ich dalsze różnicowanie w jedną z trzech linii komórkowych tworzących blastocystę są niezbędne do tego, aby zarodek mógł pomyślnie kontynuować swój rozwój poimplantacyjny wewnątrz macicy matki. Pomimo wielu lat badań, wiedza na temat tego, kiedy dokładnie komórki zaczynają różnić się zdolnością do wielokierunkowego różnicowania (w TE, PE i EPI), a ich los zostaje jednoznacznie ukierunkowany, jest niekompletna. Ponadto, mimo wielu dowodów na regulacyjny charakter rozwoju zarodków ssaków mechanizmy leżące u podstaw ich niezwykłej plastyczności także nie są do końca poznane. Celem doświadczeń opisanych w niniejszej rozprawie doktorskiej było zbadanie potencjału rozwojowego pojedynczych blastomerów bruzdkującego zarodka oraz węzłów zarodkowych (ICM) blastocyst myszy, a także sprawdzenie, jakie mechanizmy regulują rozwój zarodka i stanowią podłoże jego plastyczności. W CZĘŚCI 1. doświadczeń chciałam sprawdzić czy blastomery izolowane z zarodka 2- i 4-komórkowego różnią się zdolnością do tworzenia prekursorów/komórek poszczególnych linii komórkowych. Uzyskane w wyniku dezagregacji pary i komplety czterech pojedynczych blastomerów hodowałam do stadium blastocysty, a następnie badałam w nich ekspresję markerów EPI, PE i TE. Wykazałam, że pary izolowanych blastomerów zarodków 2-komórkowych z dużą częstością tworzą prawidłowe bliźniacze blastocysty, których ICM zawierają komórki dwóch linii: PE i EPI. Pomimo zdolności do formowania blastocyst, pary blastomerów pochodzących z zarodków 2-komórkowych różnią się potencjałem do generowania komórek EPI, PE i TE. Z kolei siostrzane blastomery kolejnego stadium, zarodka 4-komórkowego, mają już ograniczoną zdolność do rozwoju w prawidłowe blastocysty i najczęściej rozwijają się w pęcherze trofoblastyczne lub blastocysty, których ICM zawierają komórki tylko jednej z dwóch linii komórkowych: EPI lub PE. W CZĘŚCI 2. pracy podjęłam się zbadania czy potencjał rozwojowy ICM blastocyst ulega stopniowemu ograniczeniu w trakcie rozwoju, prowadząc do zaniku plastyczności przedimplantacyjnego zarodka myszy. W tym celu ICM pochodzące z wczesnych (3,5-dniowych) i późnych (4,5-dniowych) blastocyst agregowałam z zarodkiem 8-komórkowym, a następnie śledziłam rozwój utworzonych agregatów przed implantacją oraz po ich transplantacji do dróg rodnych samic biorczyń. Analiza uzyskanych blastocyst i noworodków pokazała, że ICM wczesnych i późnych blastocyst mają już ograniczony potencjał rozwojowy i nie różnicują w TE oraz jej pochodne. Wykazałam, że ICM aż do etapu późnej blastocysty są zdolne do integracji z zarodkiem 8-komórkowym i rekonstrukcji chimerowej blastocysty, która po transplantacji do jajowodów samic biorczyń może kontynuować swój rozwój aż do urodzenia. Zdolność ta maleje jednak wraz z różnicowaniem komórek PE i EPI oraz ich sortowaniem w obrębie ICM. Aby sprawdzić, czy oddziaływania parakrynne zachodzące za pośrednictwem ścieżki FGF4/ERK regulują rozwój zarodka myszy i stanowią podłoże jego plastyczności w CZĘŚCI 3. badań konstruowałam agregaty chimerowe zbudowane z ICM wczesnej 3,5-dniowej blastocysty i zarodka 8-komórkowego, w którym obniżyłam ekspresję genów Fgfr1 i Fgfr2. Stwierdziłam, że zakłócenie sygnalizacji międzykomórkowej zachodzącej za pośrednictwem receptorów FGFR1 i FGFR2 skutkuje odwróceniem proporcji komórek PE i EPI w ICM oraz nieprawidłowym rozwojem chimerowego zarodka. Oznacza to, że ścieżka sygnalizacyjna FGF4/ERK jest niezbędna do zachowania prawidłowych proporcji komórek tworzących linie komórkowe w blastocyście.

During preimplantation development of the mammalian embryo cells resulting from cleavage divisions gradually lose their potencies and differentiate into primary cell lineages: epiblast (EPI), trophectoderm (TE) and primitive endoderm (PE) which will contribute to the body of the fetus, placenta and fetal membranes. Complete loss of totipotency and their further differentiation into one of the three cell lines forming blastocyst are necessary for the embryo to continue its postimplantation development within the maternal uterus. Despite many years of research, the exact moment at which cells begin to vary in their potency to multilineage differentiation (into TE, PE and EPI) and their fate becomes clearly determined still remains unknown. Moreover, despite many lines of evidence for the regulative nature of mammalian embryos, the mechanism underlying their uncommon plasticity have not been fully elucidated. The aim of my doctoral dissertation was to investigate the developmental potency of the single cells of the cleaving embryo and the inner cell masses (ICMs) derived from the mouse blastocysts, as well as to examine the mechanisms governing the plasticity and regulative nature of the embryos. In the first part of my thesis I aimed at answering the question whether the single cells isolated from the 2- and 4-cell embryo differ in their ability to generate the precursors and cells of all three cell lineages. The pairs and sets of four single blastomeres were cultured to blastocyst stage and then the analysis of cell lineage allocation was performed. I revealed that the 2-cell stage pairs of blastomeres were often able to develop into blastocysts containing ICMs with PE and EPI cells. Despite the capacity to create a blastocyst, the sister blastomeres differed in their ability to produce EPI, PE and TE cell lines. In contrast, the sets of 4-cell stage blastomeres rarely formed normal blastocysts, but instead they developed into blastocysts with ICMs comprising of only one cell lineage or completely devoid of an ICM altogether. This indicates that the 4-cell stage sets of blastomeres feature an asymmetry of the ability to differentiate into PE and EPI. It also means that their potency is further limited in compare to the 2-cell stage blastomeres. In the second part of my doctoral thesis I investigated whether the plasticity of the ICM is gradually reduced during embryogenesis leading to decrease in the regulative capabilities of the preimplantation embryo. To address this question I aggregated ICM of the early (E.3.5) or late blastocysts (E4.5) with the 8-cell embryo and tracked development of the aggregates before implantation and after their transfer into the recipient mouse. Analysis of the resulting blastocysts and neonates proved that ICM derived from the early and late blastocysts lost the ability to differentiate into TE and its derivatives. Additionally, until the late blastocyst stage ICM can unite with the 8-cell embryo and reconstruct normal blastocyst which is able to undergo full development. However, this ability decreases with the differentiation of PE and EPI cells and their sorting within ICM. In order to investigate whether the paracrine interactions through FGF4/ERK signaling pathway regulate the embryo development and underlie its plasticity in the third part of my dissertation I constructed chimeric embryos composed of the early ICM (E.3.5) and the 8-cell embryo with decreased expression levels of Fgfr1 and Fgfr2 genes. I noticed that disruption of intercellular signaling involving FGFR1 and FGFR2 receptors inverted the proportion of PE and EPI cells within the ICM and resulted in abnormal embryo development. It means that FGF4/ERK signaling pathway is necessary to ensure the appropriate proportions of cells building the blastocyst.