Charakterystyka zmienności genów jądrowych związanych z niestabilnością mtDNA u pacjentów z chorobą mitochondrialną

Choroby mitochondrialne wynikają z nieprawidłowego funkcjonowania fosforylacji oksydacyjnej (ang. oxidative phosphorylation, OxPhos). Choroba może ujawnić się w każdym wieku. Jej objawy zazwyczaj dotyczą tkanek o wysokim zapotrzebowaniu na energię np. nerwowej czy mięśniowej i mogą obejmować tylko jeden narząd, ale zazwyczaj są bardziej złożone i dotyczą wielu narządów i układów. Przyczyną choroby mitochondrialnej mogą być zmiany sekwencji w DNA mitochondrialnym (mtDNA) lub jądrowym (nDNA). Patogenne warianty genów jądrowych zaangażowanych w utrzymanie mtDNA mogą powodować wtórną niestabilność genomu mitochondrialnego w postaci deplecji, czyli zmniejszenia liczby cząsteczek tego genomu w komórce, licznych delecji lub powstania wariantów punktowych w mtDNA. Diagnostyka chorób mitochondrialnych jest trudna i wynika z ich genetycznej oraz klinicznej heterogenności. Nie ma testu laboratoryjnego ani diagnostycznego, który mógłby potwierdzić rozpoznanie choroby mitochondrialnej. W ostatnim czasie, w diagnostyce chorób o nieznanej etiologii wykorzystuje się badania genetyczne z zastosowaniem technologii sekwencjonowania następnej generacji (ang. next generation sequencing, NGS), w tym sekwencjonowania całego eksomu (ang. whole exome sequencing, WES). W niniejszej pracy podjęto próbę określenia molekularnej przyczyny choroby mitochondrialnej w grupie 30 dorosłych pacjentów z populacji polskiej, u których wykryto obecność delecji mtDNA. Analiza wyników WES wraz z badaniami genetycznymi członków rodzin pacjentów pozwoliła na wykrycie patogennych wariantów genów RNASEH1, SLC25A4, TYMP oraz SETX i zweryfikowanie diagnozy klinicznej u 4 pacjentów. Przeprowadzone badania funkcjonalne nad nowymi wariantami w genie RNASEH1 poszerzyły wiedzę na temat ich wpływu na funkcję białka. W niniejszej pracy wykazano, że na aktywność RNazy H1 wpływają warianty zlokalizowane zarówno w domenie katalitycznej, jak i w domenie wiążącej hybrydy RNA/DNA. Wyniki te potwierdziły, że obecność patogennych wariantów spowalnia tempo replikacji mtDNA i prowadzi do powstania delecji i deplecji mtDNA. Czynnikiem inicjującym niestabilność genomu mitochondrialnego jest zaburzona obróbka nici 7S DNA przez RNazę H1. Ponadto wykazano, że warianty patogenne w RNASEH1 negatywnie wpływają na procesy transkrypcji i translacji genomu mitochondrialnego, a w konsekwencji prowadzą do zaburzenia OxPhos.

Mitochondrial diseases are due to defects in mitochondrial oxidative phosphorylation (OxPhos). The disease may present at any age and typically its symptoms affect tissues with high energy needs, such as nerves and muscles. The symptoms may affect a single organ, but usually, they are more complex and can involve multiple organs and systems. Mitochondrial disease can result from either mitochondrial (mtDNA) or nuclear (nDNA) DNA mutations. Pathogenic variants in nuclear genes involved in mtDNA maintenance can cause secondary instability of the mitochondrial genome in the form of depletion - decreased number of mtDNA molecules in the cell, vast multiple deletions or mtDNA point variants. Mitochondrial diseases are difficult to diagnose because of their genetic and clinical heterogeneity. There is no single laboratory or diagnostic test that can confirm the diagnosis of mitochondrial disease. Recently, the diagnosis of diseases of unknown etiology has started to be based on genetic tests with the use of next-generation sequencing (NGS) technology, including whole exome sequencing (WES). In this study, an attempt was made to determine the molecular cause of mitochondrial diseases in a group of 30 adult patients from the Polish population, in whom the presence of mtDNA deletions was detected. The analysis of the WES and results of genetic tests of the patients' family members allowed to detect pathogenic variants of the RNASEH1, SLC25A4, TYMP and SETX genes and the clinical verification of the diagnosis for 4 patients. Functional studies broadened the knowledge about new variants in the RNASEH1 gene and their impact on the function of the encoded protein. Here I have shown that variants located in the catalytic domain as well as in the RNA/DNA hybrid binding domain affect RNase H1 activity. These results confirm that the presence of pathogenic variants slows down the mtDNA replication rate and leads to mtDNA deletions and depletion. The factor that initiates the instability of the mitochondrial genome is the disturbed turnover of the 7S DNA strand by RNase H1. Moreover, it has been shown that pathogenic variants of RNASEH1 negatively affect the transcription and translation processes of the mitochondrial genome and lead to OxPhos dysfunction.