Dynamika kawitacji zarodków myszy i rola akwaporyn w tym procesie

Ostatnim stadium przedimplantacyjngo rozwoju zarodków ssaków jest blastocysta. Utworzenie prawidłowej blastocysty, zarówno pod względem morfologicznym i funkcjonalnym, jest niezbędne do implantacji zarodka w macicy, jego dalszego rozwoju i różnicowania. Kluczowym procesem prowadzącym do powstania blastocysty jest kawitacja, czyli utworzenie wewnątrz zarodka jamy wypełnionej płynem. Jest to skomplikowany i złożony proces, a mechanizmy, które umożliwiają jego zajście nie są jeszcze w pełni poznane. Sugeruje się, że za efektywny napływ wody do jamy blastocysty odpowiadają białka z rodziny akwaporyn (AQP). Dotychczasowe doniesienia dotyczące analizy ekspresji poszczególnych akwaporyn w rozwoju przedimplantacyjnym nie są jednak w pełni spójne, jak również brakuje informacji co do roli akwaporyn w procesach związanych z funkcjonalnością trofektodermy (zewnętrznej warstwy komórek blastocysty, która odpowiada za implantację zarodka). Powstająca jama blastocysty początkowo powiększa się w stałym tempie, a następnie obserwuje się tzw. pulsacje, czyli oscylacyjne zmiany objętości jamy, a co za tym idzie całego zarodka. Badania z ostatnich lat sugerują powiązanie dynamiki tych pulsacji z wielkością zarodka oraz z biomechanicznymi właściwościami trofektodermy. Pulsacje blastocysty obserwuje się m.in. w zarodkach ludzkich – podejmowane są próby powiązania występowania silnych skurczów blastocysty z jakością zarodka, jednak doniesienia na ten temat są sprzeczne. Celem doświadczeń w niniejszej rozprawie było zbadanie czy dynamika kawitacji mysich zarodków, oceniona za pomocą nieinwazyjnej metody filmowania poklatkowego w świetle przechodzącym, odzwierciedla jakość zarodka, jak również sprawdzenie roli akwaporyn, w szczególności AQP3 i AQP7, w procesach zależnych od trofektodermy. W Części 1. doświadczeń sprawdziłam, czy istnieją charakterystyczne zakresy parametrów dynamiki kawitacji, które wskazywałyby na wysoką bądź niską jakość zarodka. W tym celu analizowałam dynamikę kawitacji zarodków (i) o podwojonej liczbie komórek, (ii) o obniżonym potencjale rozwojowym (uzyskanych z oocytów poddanych starzeniu matczynemu lub poowulacyjemu), oraz (iii) o zróżnicowanych zdolnościach do implantacji. Wykazałam, że zarodki o większej liczbie komórek wcześniej rozpoczynają kawitację, a ich skurcze są rzadkie i słabe. Z kolei blastocysty powstałe z oocytów poddanych starzeniu matczynemu lub poowulacyjnemu później rozpoczynają tworzenie jamy. Pokazałam również, że zarodki które utworzyły nieprawidłowe (małe) rozrosty lub w ogóle nie utworzyły rozrostu cechują się dłużej trwającymi skurczami, a ich rozkurcze osiągają niższą amplitudę. Uzyskane dane nie wskazują jednak silnej zależności pomiędzy dynamiką kawitacji a jakością zarodka. Część 2. pracy stanowią doświadczenia weryfikujące rolę AQP3 i AQP7 w różnych procesach zależnych od trofektodermy. Wykorzystując chemiczne inhibitory, jak również wywołując deplecję za pomocą mikroiniekcji siRNA, pokazałam, że AQP3 i AQP7 nie są niezbędne do rozpoczęcia gromadzenia płynu wewnątrz zarodka, choć regulują tempo i zakres ekspansji jamy. AQP3 zdaje się mieć większą rolę w tych procesach niż AQP7, co jest zgodne z profilem ekspresji ich mRNA w zarodkach. Co więcej, zablokowanie aktywności tych białek skutkuje znaczącym ograniczeniem zdolności blastocysty do implantacji w warunkach in vitro. Wykazałam również, że, w pewnym stopniu, białka te wpływają na podatność blastocysty na proces witryfikacji, jak również na dynamikę odtwarzania jamy po rozmrożeniu. Sugeruje to, że AQP3 i AQP7 są istotnymi regulatorami funkcjonalności trofektodermy zarodków myszy.

The blastocyst is the last stage in the preimplantation development of a mammalian embryo. Formation of a properly formed blastocyst, both morphologically and functionally, is essential for future embryo implantation in the uterus, further development and differentiation. The key event leading to the blastocyst formation is cavitation, i.e. formation of a fluid-filled cavity within the embryo. It is a complicated and complex process, and the mechanisms that enable it have not been fully investigated yet. It has been suggested, that aquaporins (AQPs) might be responsible for efficient water influx into the blastocyst cavity. Up to now, reported analyses of AQPs expression within the preimplantation period are not fully consistent. Moreover, there is a lack of information concerning the role of AQPs in processes related to the functionality of the trophectoderm (the outer layer of a blastocyst, responsible for the embryo implantation). Initially, the forming cavity expands constantly, and then oscillatory changes in the cavity (and thus embryo) volume are observed and called blastocyst pulsations. Studies published in the last few years suggest, that the dynamics of those pulsations, embryo size, and biomechanical properties of the trophectoderm are intertwined. Blastocyst pulsations are observed e.g. in human embryos - attempts are being made to link the occurrence of strong blastocyst contractions with the quality of the embryo, but reports on this subject are contradictory. My doctoral dissertation aimed to examine whether the dynamics of mouse embryo cavitation, assessed non-invasively by time-lapse in brightfield, reflects embryo quality, as well as to investigate the role of aquaporins, in particular AQP3 and AQP7, in trophectoderm-related processes. In the first part of my dissertation, I investigated whether there are particular ranges of the cavitation dynamics parameters that suggest high or poor embryo quality. To address this question, I analyzed the dynamics of cavitation in (i) double-sized embryos, (ii) poor-quality embryos (derived from oocytes subjected to maternal or postovulatory aging), and (iii) embryos displaying various potentials for implantation. I revealed, that double-sized embryos start to cavitate earlier and exhibit less frequent and weaker contractions. On the other hand, in blastocysts derived from oocytes subjected to maternal or postovulatory aging, I observed delayed cavitation. Moreover, I noticed that blastocysts unable to implant in vitro properly (i.e. forming too small outgrowths or not forming outgrowths at all) contract longer than embryos that form correct outgrowths, and their reexpansion phases are weaker. However, the data I obtained do not indicate a strong relationship between the dynamics of cavitation and embryo quality. The second part of my doctoral thesis concerned the verification of the role of AQP3 and AQP7 in various trophectoderm-dependent processes. Using chemical inhibitors as well as causing depletion by siRNA microinjection I revealed, that AQP3 and AQP7 are not essential for the initiation of fluid accumulation within the embryo, although they regulate the rate and range of cavity expansion. It seems that AQP3 exhibits a more significant role in those processes than AQP7, which is in accordance with the mRNA expression profiles in embryos. Moreover, inhibition of these proteins resulted in a significant decrease in the blastocyst’s ability to implant in vitro. I also proved, that, to a certain extent, those aquaporins have an influence on blastocyst receptivity to vitrification as well as the dynamics of cavity reexpansion after warming. It indicates, that AQP3 and AQP7 are crucial regulators of the trophectoderm functionality in mouse embryos.