Elektrochemiczna detekcja wybranych białek i cukrów z wykorzystaniem układów mediowanych

Niniejsza rozprawa doktorska dotyczy zagadnienia konstrukcji czujników elektrochemicznych do mediowanej detekcji istotnych z medycznego punktu widzenia biomolekuł. Praca ma klasyczny układ, jest podzielona na dwie części: teoretyczną i eksperymentalną. Część teoretyczna składa się z siedmiu rozdziałów i rozpoczyna się uzasadnieniem podjęcia tematyki dysertacji oraz sprecyzowaniem celów badawczych. W kolejnych rozdziałach zostały opisane wybrane biocząsteczki ze szczególnym uwzględnieniem białek: ceruloplazminy i białka C-reaktywnego oraz cukrów: glukozy. Z uwagi na fakt, że niniejsza rozprawa dotyczy mediowanej detekcji wybranych białek i cukrów w części literaturowej przedstawiono również zagadnienia związane z elektroaktywnością biocząsteczek oraz sposobami transportu elektronów pomiędzy biocząsteczką a powierzchnią elektrody. W niniejszej rozprawie opisano czujniki bazujące na mediowanym transporcie elektronów do detekcji ceruloplazminy, białka C-reaktywnego oraz glukozy z wykorzystaniem nowo zsyntezowanych koniugatów ferrocenu. Funkcjonalność zaproponowanych narzędzi diagnostycznych sprawdzono na próbkach rzeczywistych jak osocze krwi, czy też napoje typu „soft drink”. W przygotowaniu warstwy analitycznie aktywnej do mediowanej detekcji ceruloplazminy wykorzystano koniugat (nanocząstka magnetyczna z żelaznym rdzeniem)-ferrocen. Paramagnetyczne właściwości samej ceruloplazminy, jak i stosowanego układu receptorowego pozwoliły na prowadzenie pomiarów w obecności zewnętrznego źródła pola magnetycznego, co w konsekwencji znacznie poprawiło parametry analityczne czujnika takie jak: selektywność, czas życia czujnika oraz umożliwiło prowadzenie oznaczeń na ultra-niskim poziomie w próbkach rzeczywistych. Z kolei wykorzystanie zjawiska okluzji próbnika redoks pomiędzy cząsteczkami białka unieruchomionego na powierzchni elektrody na skutek specyficznego oddziaływania antygen – przeciwciało umożliwiło woltamperometryczną detekcję nieelektroaktywnego białka CRP, biomarkera stanów zapalnych. Kolejnym czujnikiem przedstawionym w dysertacji był czujnik do monitorowania dyskretnych zmian stężenia glukozy, umożliwiający wczesną diagnostykę wielu chorób, jak również kontrolę poziomu cukrów w procesach technologicznych, np.: fermentacja. W tym przypadku zastosowano dwa różne podejścia, wykorzystując w roli receptora zredukowany tlenek grafenu domieszkowany różnymi pochodnymi ferrocenu oraz polimerowe pochodne kwasu fenyloboronowego. Wykorzystując nowo zsyntezowane receptory rGO-Fc oraz oksydazę glukozową skonstruowano bioczujniki II generacji. Na podstawie przeprowadzonych badań udowodniono, że sposób wprowadzenia ferrocenu na powierzchnię rGO, jak również funkcjonalizacja próbnika redoks grupami karboksylowymi pozwoliła na zminimalizowanie ilości enzymu w warstwie receptorowej z zachowaniem jego maksymalnej aktywności. Zaproponowane czujniki do amperometrycznej detekcji glukozy umożliwiają oznaczanie tego cukru na bardzo niskim poziomie. Badania z wykorzystaniem koniugatu rGO-ferrocen dotyczyły nie tylko aspektów analitycznych, ale również określenia wpływu obecności ferrocenu na strukturę rGO oraz orientacji cząsteczek ferrocenu względem grafenu. Te elementy są ważnym wkładem w zrozumienie działania czujnika. Podejście z wykorzystaniem polimerowych pochodnych kwasu fenyloboronowego umożliwiło detekcję glukozy w obecności fruktozy. Proces rozpoznania glukozy opierał się na różnicy w powinowactwie zastosowanych pochodnych kwasu fenyloboronowego względem glukozy i próbnika redoks. Zgodnie z najnowszą wiedzą, taki sposób oznaczania glukozy został zademonstrowany po raz pierwszy. Dodatkowo, czujnik charakteryzował się dużą czułością, selektywnością, niską granicą wykrywalności i łatwością konstrukcji. Przedstawione w niniejszej rozprawie doktorskiej wyniki stały się podstawą publikacji naukowych w międzynarodowych czasopismach o bardzo wysokim współczynniku oddziaływania (IF), tj. Biosensors & Bioelectronics

This PhD thesis relates to the construction issue of electrochemical sensors for mediated detection of medically important biomolecules. This thesis has a classic layout, and it is divided into two main parts: theoretical and experimental. The theoretical part consists of seven chapters and begins with a justification of the subject of the dissertation and specification of research objectives. The following chapters describe selected biomolecules with emphasis on proteins: ceruloplasmin, C-reactive protein, and sugars: glucose. Due to the fact that this dissertation concerns the mediated detection of selected proteins and sugars, the literature also presents important issues related to the electroactivity of biomolecules and types of electron transport between the biomolecule and the electrode surface. Much attention was also paid to the commercial methods of selected proteins and sugars analysis, emphasizing the role of nanomaterials in the construction of bioplatforms for sensors. This PhD thesis describes mediated electron transport sensors for the detection of ceruloplasmin, C-reactive protein, and glucose using newly synthesized ferrocene conjugates. The functionality of the proposed diagnostic devices was checked on real samples such as blood plasma or soft drinks. In the preparation of the analytically active layer for mediated detection of ceruloplasmin, a conjugate (magnetic nanoparticle with an iron core)-ferrocene was used. The paramagnetic properties of ceruloplasmin and the applied receptor system allowed of measurements in the presence of an external magnetic field source, which significantly improved the sensor's analytical parameters such as selectivity, sensor lifetime, and enabled an exceptionally low level of detection in real samples. The usage of redox probe occlusion phenomenon between protein molecules immobilized on the electrode surface due to the specific interaction of antigen-antibody enabled a voltammetric detection of non-electroactive CRP protein, a biomarker of inflammation. Another device presented in the dissertation was a sensor monitoring discrete changes of glucose concentration, which enables the early diagnostics of many diseases, as well as control of sugar levels in technological processes, e.g. fermentation. In this case, two different approaches were chosen, using reduced graphene oxide doped with various ferrocene derivatives and polymer derivatives of phenylboronic acid as receptors. Second generation biosensors were constructed using newly synthesized rGO-Fc receptors and glucose oxidase. Based on the conducted research, it was proved that the method of ferrocene introducing to the surface of rGO, as well as the functionalization of the redox probe with carboxyl groups allowed to minimize the amount of enzyme in the receptor layer while maintaining its maximum activity. The proposed sensors for amperometric determination of glucose enable the detection of this sugar at a very low level. Research on the rGO-ferrocene conjugate concerned not only the analytical aspects but also defining the effect of ferrocene presence on the structure of rGO and the orientation of ferrocene molecules relative to graphene. These elements are an important contribution to understanding the operation of the sensor. The approach using polymeric phenylboronic acid derivatives enabled the detection of glucose in the presence of fructose. The glucose recognition process was based on the difference between the affinity of the phenylboronic acid derivatives for glucose and the redox probe. According to recent knowledge, this method of glucose determination has been demonstrated for the first time. In addition, the sensor is characterized by high sensitivity, selectivity, low detection limit, and ease of its construction. The results presented in this dissertation have become the basis for scientific publications in international journals with a very high impact factor (IF), Biosensors & Bioelectronics.