Zastosowanie analizy genów markerowych do badań zakwitów toksycznych cyjanobakterii w jeziorach

Zakwity cyjanobakterii stanowią poważny problem w ekosystemach wodnych. Często towarzyszą im toksyny, wśród których mikrocystyny są najczęstszym zagrożeniem w zbiornikach słodkowodnych. Wielkie Jeziora Mazurskie to obszar cenny pod względem przyrodniczym i turystycznym. W WJM występuje duża różnorodność taksonomiczna cyjanobakterii, zwykle dominują one latem w biomasie fitoplanktonu. Jeziora, pomimo że połączone, różnią się pod względem trofii, co sprawia, że stanowią znakomity model do badania wpływu czynników środowiskowych na zespoły sinic. Celem pracy była kompleksowa analiza, z zastosowaniem metod biologii molekularnej, różnorodności zespołów cyjanobakterii, w tym cyjanobakterii potencjalnie toksycznych, w wybranych WJM.Porównano dwie metody badania składu taksonomicznego cyjanobakterii – mikroskopową i DGGE-sekwencjonowanie. Wykazano, że do pełnej identyfikacji niezbędne są metody mikroskopowe. Metoda molekularna może być stosowana do określenia występowania taksonów dominujących, a jej przewagą jest krótszy czas uzyskania wyników, zwłaszcza w przypadku licznych próbek.DGGE pozwoliło na prześledzenie zmian w zespołach sinic w czasie, oraz określenie czynników wpływających na podobieństwa i różnice między nimi. W badanych jeziorach najbardziej zróżnicowana struktura taksonomiczna występuje latem. Najważniejszym czynnikiem wpływającym na podobieństwo zespołów jest okres, w którym pobierano próbkę. W większości jezior istnieje podobny potencjał występowania poszczególnych taksonów, ale ich liczebność zależna jest od panujących warunków. Oznacza to, że nawet jeziora o niskiej trofii, w odpowiednich warunkach mogą być zagrożone zakwitami.Zaproponowano procedurę rozpoznawania toksycznych cyjanobakterii w próbkach środowiskowych z zastosowaniem analizy DGGE-mcyA. Stwierdzono, że pomimo dużego zróżnicowania taksonomicznego cyjanobakterii, jedynie przedstawiciele rodzajów Microcystis i Planktothrix mogą wytwarzać mikrocystyny. Toksyczne genotypy znajdowano we wszystkich badanych jeziorach, jednak częściej wykrywano te należące do Planktothrix spp.Ponieważ nowe doniesiania wskazują, że do toksycznych sinic należą również pikocyjanobakterie, sprawdzono, czy szczepy Synechococcus spp., wyizolowane z jezior mazurskich, posiadają geny odpowiadające za wytwarzanie mikrocystyn. Wykazano, że w jednym ze szczepów obecne są geny klastra mcy. Sekwencje mcyADE, są pierwszymi znanymi sekwencjami mcy należącymi do pikocyjanobakterii.Badania z zastosowaniem qPCR pozwoliły na prześledzenie zmian w udziale toksycznych genotypów w całkowitej liczebności Microcystis i Planktothrix spp. Udział toksycznych komórek Microcystis spp. był zmienny, ale w większości próbek niski. Nie zaobserwowano tendencji, z jaką udział toksycznych komórek Microcystis spp. zmieniałby się w czasie sezonu wegetacyjnego. W populacjach Planktothrix spp. udział toksycznych genotypów był zawsze wysoki, choć zaobserwowano też tendencję do jego zmniejszania się w czasie sezonu. Stwierdzono, że na podstawie udziału toksycznych komórek Planktothrix spp. można prognozować zagrożenie wystąpieniem toksycznego zakwitu w badanym jeziorze w późniejszym czasie. Wyniki wskazują też, że przypadki osiągnięcia dużej biomasy przez mazurskie populacje Planktothrix spp. zawsze będą wiązały się z ryzykiem pojawienia się mikrocystyn. Wykazano korelację pomiędzy liczebnością toksycznych komórek Planktothrix spp. a stężeniem toksyn. Oznacza to, że głównym taksonem cyjanobakterii odpowiedzialnym za wytwarzanie mikrocystyn w badanych jeziorach jest rodzaj Planktothrix.Dla pełnego obrazu zależności związanych toksycznymi zakwitami badano, czy mikrocystyny w WJM mogą być degradowane przez naturalne zespoły bakterii. Potwierdzono, że w badanych jeziorach występują bakterie z rodziny Sphingomonadaceae, mogące rozkładać mikrocystyny. Bakterie te w jeziorach mazurskich występują głównie w osadach dennych, a do wód powierzchniowych mogą rozprzestrzeniać się w sprzyjających warunkach środowiska.

Cyanobacterial blooms are a serious problem for aquatic ecosystems. They are often accompanied by the presence of toxins, among which microcystins are the most common threat to freshwater lakes. The Great Masurian Lakes system is a lakes complex extremely valuable in terms of nature and tourism. Cyanobacteria usually predominate in the total biomass of phytoplankton; there is also large taxonomic variety of cyanobacteria in the GML waters. Lakes belonging to the system, even though they are all connected, differ in the trophic status. This makes the GML system an excellent model to study the influence of environmental factors on the cyanobacteria communities. The aim of this study was comprehensive analysis, using molecular biology methods, of the diversity of cyanobacteria communities, including potentially toxic cyanobacteria, in selected GML.A comparative analysis of two methods of cyanobacteria taxonomic composition determination – microscopic and molecular (DGGE-sequencing), was conducted. It has been shown that for complete identification is still necessary to use microscopic methods. However, molecular method can be used to determine the presence of dominant taxa. Its advantage is a shorter time needed, especially in cases of multiple samples analysis.DGGE allowed to track changes in cyanobacteria communities in time and to determine what factors influence the similarities and differences between them. In the studied lakes the most diversified taxonomic structure of cyanobacteria occurs in the summer. The most important factor influencing the similarity between the cyanobacteria communities was the period in which the sample was taken. In most lakes, there is a similar potential for the occurrence of individual taxa, but the actual number depends on the environmental conditions. This means that even lakes with relatively low trophic status may be at risk of cyanobacteria bloom in suitable conditions.A procedure for identification toxic cyanobacteria in environmental samples, using DGGE-mcyA, was proposed. The results indicate that despite the large diversity of cyanobacteria, only two genera - Planktothrix and Microcystis can produce microcystins. Toxic genotypes were found in all studied lakes, but Planktothrix spp. was detected much more often.Recent reports indicate that among the toxic cyanobacteria are also picocyanobacteria taxa. The presence of toxicity genes was tested in Synechococcus spp. strains, isolated from GML. One strain has in its genome mcy gene cluster. Three sequences - mcyADE, are the first known sequences of mcy genes belonging to picocyanobacteria.qPCR analyses allowed tracing changes in the share of toxic genotypes in the total populations of Planktothrix and Microcystis spp. Participation of toxic cells in Microcystis spp. was variable, but low in most samples. There was not any trend in changes of the share of toxic Microcystis spp. during the season. In Planktothrix spp. populations the proportion of toxic genotypes were always very high, however there was a tendency to its slight decrease during the vegetation season. Forecasting of toxic bloom on the basis of the share of Planktothrix spp. toxic cells is possible. However, increased biomass of Planktothrix spp. populations will always be associated with the risk of microcystins occurrence. A correlation between the number of toxic Planktothrix spp. cells and the concentration of toxin was found. This means that Planktothrix spp. is the main taxon responsible for microcystins production.For a better knowledge of factors influencing cyanobacteria communities the last aim of the study was to determine, whether in GML occurs bacterial degradation of microcystins. Results showed that in the studied lakes occur microcystins-degrading bacteria, classified to Sphingomonadaceae family. These bacteria were predominantly found in bottom sediments. Probably they can also be spread to surface water in favorable conditions.