Factors shaping variability of carbon and nitrogen stable isotopes in bone collagen of red deer (Cervus elaphus) from European populations since the Late Pleistocene until today

Jeleń szlachetny (Cervus elaphus) jest najbardziej rozpowszechnionym gatunkiem z rodziny jeleniowatych (Cervidae) na świecie. Zamieszkuje zróżnicowane środowiska, zarówno obszary nizinne, jak i górskie, tereny gęsto zalesione oraz otwarte. Jest również licznie reprezentowany na stanowiskach archeologicznych i paleontologicznych w Eurazji. Jelenie szlachetne dzielą się na dwie główne linie filogenetyczne: wschodnią i zachodnią. Do pierwszej należą m.in jelenie wapiti, a do drugiej m.in jelenie europejskie. Linie te są w znacznym stopniu rozdzielone geograficznie, różnią się morfologicznie, zasiedlają nieco odmienne środowiska, a także są przystosowane do innych warunków klimatycznych. Jelenie wapiti są lepiej przystosowane do klimatu chłodniejszego, borealnego, zamieszkują tereny centralnej, wschodniej i południowej Azji oraz Amerykę Północną. Jelenie europejskie są związane z klimatem cieplejszym tzn. zasiedlają obszary strefy umiarkowanej i śródziemnomorskiej. Ich naturalny zasięg występowania obejmuje Europę, Bliski Wschód oraz północną Afrykę. W okresie od późnego plejstocenu do współczesności zasięg jelenia szlachetnego zmieniał się wraz ze zmianami klimatu: zmniejszał się, kiedy klimat się ochładzał i zwiększał, gdy klimat ulegał ociepleniu. Najmniejszy zasięg tego gatunku stwierdzono w okresie ok. 18-26 tys. lat temu, w trakcie maksimum ostatniego zlodowacenia. Jeleń przetrwał ten okres w refugiach glacjalnych na Półwyspie Iberyjskim, Apenińskim i Bałkańskim oraz w zachodniej części Europy, a także w Karpatach, w okolicach Morza Czarnego i na Uralu. Po ustąpieniu lodowca i w trakcie ocieplania się klimatu w holocenie gatunek ten ponownie zasiedlił znaczne obszary kontynentu. Dotychczasowe badania izotopów stabilnych węgla i azotu wykazały, że określenie ich zawartości w tkankach zwierząt pozwala m.in. na odtworzenie warunków środowiskowych, w jakich zwierzęta te żerowały. W badaniach paleoekologicznych do analiz izotopowych wykorzystywane są kości zwierząt, jednak zazwyczaj dostępna ilość materiału jest ograniczona. Ponadto, porównywane są ze sobą wyniki analiz kości z różnych części szkieletu i pochodzące od osobników różnego wieku i płci. Do tej pory brakowało danych pokazujących, czy wyniki analiz tak zróżnicowanego materiału kostnego mogą być ze sobą porównywane. Nie było również badań, w których kompleksowo analizowano czynniki środowiskowe kształtujące poziom izotopów 13C i 15N w kolagenie kostnym jeleni współczesnych. Takie dane są niezbędne do odtwarzania środowisk żerowania jeleni w przeszłości. Głównymi celami mojej rozprawy doktorskiej były: (Publikacja 1) porównanie zawartości izotopów stabilnych węgla (13C) i azotu (15N) w kolagenie kostnym na poziomie wewnątrzosobniczym (pomiędzy różnymi częściami tych samych kości, pomiędzy różnymi kośćmi tych samych osobników), wewnątrzpopulacyjnym (pomiędzy osobnikami różnej płci i wieku z tych samych populacji) oraz międzypopulacyjnym u jeleni z europejskich populacji zamieszkujących różne środowiska; (Publikacja 2) zbadanie, które z czynników środowiskowych w największym stopniu determinują poziom izotopów stabilnych 13C i 15N w kolagenie kostnym współczesnych jeleni z populacji europejskich; (Publikacja 3) zbadanie, z wykorzystaniem analizy izotopów stabilnych węgla i azotu w kolagenie kostnym, czy i jak zmieniało się środowisko, w którym żerowały jelenie szlachetne (Cervus elaphus) w Eurazji w ciągu ostatnich 50 tys. lat; sprawdzenie, czy środowiska żerowania jeleni należących do różnych linii filogenetycznych i haplogrup mitochondrialnego DNA (mtDNA) były różne oraz wykazanie, które spośród analizowanych czynników środowiskowych w największym stopniu determinowały zawartości stabilnych izotopów w kolagenie kostnym jelenia europejskiego w holocenie. Postawiłem następujące hipotezy badawcze: 1) na zawartość izotopów stabilnych węgla 13C i azotu 15N miały wpływ: rodzaj badanej kości oraz płeć i wiek badanych osobników, a także warunki środowiska w którym żerowały (Publikacja 1); 2) spośród analizowanych warunków środowiskowych procentowy udział powierzchni zalesionej (lesistość), roczna suma opadów, średnia temperatura stycznia i wysokość nad poziomem morza (n.p.m.) oraz (na terenach nadmorskich) także odległość od morza najistotniej wpływały na zawartość izotopów stabilnych węgla 13C i azotu 15N w kościach jeleni (Publikacja 2); 3) siedliska, w jakich żerowały jelenie w ciągu w ciągu ostatnich 50 tys. lat zmieniały się w czasie i przestrzeni w Eurazji, w zależności od zmian klimatycznych i środowiskowych (Publikacja 3); 4) siedliska żerowania jeleni były odmienne dla osobników należących do różnych linii filogenetycznych i haplogrup mtDNA (Publikacja 3); 5) lesistość, temperatura, opady i wysokość n.p.m., najlepiej wyjaśniały zmienność poziomu izotopów stabilnych węgla i azotu w kolagenie kostnym jeleni europejskich w holocenie (Publikacja 3). Do analiz zmienności wewnątrzosobniczej oraz wewnątrzpopulacyjnej wykorzystałem 322 próby kostne, w większości zebrane w latach 2007-2018 na terenie Polski, Słowenii i Wielkiej Brytanii (Szkocji). W analizach tych porównałem skład izotopowy węgla i azotu pomiędzy różnymi fragmentami tych samych kości (żuchw), pomiędzy kośćmi pochodzącymi z różnych części szkieletu (żuchwy, paliczki, kości śródstopia) tych samych osobników oraz w kościach osobników różnej płci i w różnym wieku z tych samych populacji (Publikacja 1). Do analizy zmienności międzypopulacyjnej wykorzystałem próby od 242 osobników z 15 lokalizacji (z Polski, Słowenii, Szkocji i Holandii) zebrane w większości w latach 2007-2019. Lokalizacje były zróżnicowane pod względem położenia geograficznego, ukształtowania krajobrazu oraz lesistości. Były to zarówno tereny gęsto zalesione, jak i obszary o niskiej lesistości, polno-leśne, otwarte, górskie, nizinne oraz nadmorskie. Zbadałem, które z czynników środowiskowych (lesistość, wysokość n.p.m., roczna suma opadów, średnia temperatura roczna, średnie temperatury stycznia i lipca) warunkują zmienność poziomu izotopów stabilnych 13C i 15N w kolagenie kostnym jeleni z różnych lokalizacji (Publikacja 2). Do porównania zawartości izotopów stabilnych węgla 13C i azotu 15N pomiędzy kolagenem kostnym jeleni współczesnych i kopalnych wykorzystałem 49 losowo wybranych prób spośród analizowanych w poprzednich pracach prób współczesnych oraz 74 datowane radiowęglowo próby kopalne z ostatnich 50 tys. lat z różnych obszarów Eurazji. Próby te, na podstawie wcześniejszych badań, zostały przypisane do jednej z dwóch linii: jeleni europejskich lub wapiti oraz ich haplogrup mtDNA. Dodatkowo do analiz włączyłem dane literaturowe (478 prób) z ostatnich 50 tys. lat z Europy. Zebrany materiał wykorzystałem do sprawdzenia, jak zmieniało się środowisko żerowania jeleni od późnego plejstocenu do współczesności. Ponadto przeanalizowałem, które z wybranych czynników (wiek radiowęglowy próby, haplogrupa mtDNA, średnia temperatura roczna, średnie temperatury stycznia i lipca, suma opadów rocznych, sumy opadów stycznia i lipca, wysokość n.p.m., biom, lesistość) warunkowały zmienność poziomu izotopów stabilnych 13C i 15N w kolagenie jeleni europejskich z holocenu. (Publikacja 3). Analizując zmienności wewnątrzosobniczą wykazałem wysoką korelację poziomu izotopów stabilnych 13C i 15N pomiędzy kośćmi pochodzącymi z różnych części szkieletu jeleni (paliczkiem I i żuchwą). Stwierdziłem również wysoką korelację zawartości 13C i 15N pomiędzy parami kości długich pobranych od tych samych osobników (paliczkiem I, paliczkiem II i kością śródstopia) oraz pomiędzy parami trzech różnych fragmentów tych samych kości żuchwy (trzonem, kątem, wyrostkiem dziobiastym). Analizując zmienność wewnątrzpopulacyjną nie stwierdziłem zależności pomiędzy zawartością badanych izotopów w kolagenie kostnym, a płcią i wiekiem badanych osobników. Otrzymane wyniki pozwoliły na odrzucenie zaproponowanych wcześniej hipotez dotyczących zmienności wewnątrzosobniczej oraz wewnątrzpopulacyjnej (Publikacja 1). Analizując zmienność międzypopulacyjną wykazałem, że najniższe wartości izotopu węgla 13C zawierały kości osobników z zalesionych terenów górskich, natomiast najwyższe wartości stwierdziłem w próbach jeleni z terenów otwartych. Najniższe wartości izotopu azotu 15N zaobserwowałem u osobników pochodzących z zalesionych terenów górskich, a najwyższe wartości odnotowano u jeleni z nadmorskich terenów otwartych (Publikacja 2). Wykazałem, że czynnikiem najlepiej wyjaśniającym zmienność izotopu stabilnego węgla 13C w kolagenie kostnym jeleni współczesnych była lesistość. Zmienność izotopu azotu 15N najlepiej wyjaśniał model uwzględniający procentowy udział terenów otwartych. Ponadto wykazałem, że zawartość 15N w kolagenie kostnym jeleni zasiedlających tereny nadmorskie malała wraz z odległością od morza. Na podstawie wyników uzyskanych w ramach tych analiz potwierdziłem hipotezy dotyczące wpływu środowiska żerowania jeleni na zawartości izotopów stabilnych węgla 13C i azotu 15N w ich kolagenie kostnym (Publikacja 2). Wykazałem, że w ciągu ostatnich 50 tys. lat siedliska żerowania jeleni w Eurazji zmieniały się wraz ze zmianami środowiska (np. ekspansją lasów związaną z ociepleniem klimatu), a także w odpowiedzi na zmiany krajobrazu związane z działalnością człowieka (np. wylesianie i rozprzestrzenianie się rolnictwa). Porównując zawartości izotopów stabilnych 13C i 15N w kolagenie kostnym jeleni współczesnych i kopalnych wykazałem istotne różnice pomiędzy nimi, zwłaszcza w przypadku izotopu 13C. Poziom izotopu 13C wśród wszystkich analizowanych osobników (łącznie z danymi literaturowymi) w ciągu ostatnich 50 tys. lat był najniższy u jeleni współczesnych. Prawdopodobnie wynika to z faktu, że większość współcześnie żyjących jeleni zasiedla tereny o najwyższej lesistości w porównaniu do osobników tego gatunku żyjących w przeszłości w ciągu ostatnich 50 tys. lat. (Publikacja 3). Na podstawie przeprowadzonych analiz, stwierdziłem, że w okresie późnego plejstocenu wartości 13C i 15N w kościach jeleni europejskich były w zakresie wartości uzyskanych dla wapiti. W holocenie natomiast, wartości 13C i 15N w kościach wapiti były w zakresie wartości jeleni europejskich. Prawdopodobnie wynika to z podobnych siedlisk żerowania jeleni należących do tych dwóch linii genetycznych (Publikacja 3). W kolejnym etapie badań wykazałem, że czynnikami najlepiej wyjaśniającym zmienność izotopu węgla 13C w kolagenie kostnym jeleni holoceńskich są lesistość i średnia temperatura lipca. Zmienność izotopu azotu 15N najlepiej wyjaśniały roczna suma opadów, średnia temperatura lipca oraz wysokość n.p.m. (Publikacja 3). Podsumowując, na podstawie analiz prób kostnych współczesnych jeleni stwierdziłem, że badania paleoekologiczne wykorzystujące analizy izotopów stabilnych węgla 13C i azotu 15N mogą być prowadzone z wykorzystaniem różnych kości szkieletu, bez uwzględniania płci i wieku osobników (z wyłączeniem młodych, które odżywiają się mlekiem matki). Wykazałem, że najistotniejszym czynnikiem środowiskowym w kształtowaniu się poziomu izotopu 13C i w kolagenie kostnym jeleni współczesnych jest lesistość, a poziomu izotopu 15N – procentowy udział terenów otwartych. W holocenie najistotniejszym w kształtowaniu się poziomu izotopu stabilnego węgla 13C była, podobnie jak w przypadku materiału współczesnego, lesistość oraz dodatkowo średnia temperatura lipca. W przypadku izotopu azotu 15N najistotniejszymi czynnikami okazały się roczna suma opadów, średnia temperatura lipca oraz wysokość n.p.m.. W późnym plejstocenie i holocenie w Eurazji siedliska żerowania jeleni zmieniały się zgodnie ze zmianami środowiska.

Summary Red deer (Cervus elaphus) is the most widespread deer species (Cervidae) in the world inhabiting diverse environments, lowlands and mountains, densely forested and open areas. It is abundant in archaeological and paleontological sites across Eurasia. Red deer species is divided into two main phylogenetic lines: the eastern and the western. The first line comprises, i.e. the wapiti deer, and the second one comprises i.e. the European deer. The ranges of these lines do not overlap geographically. Deer from eastern and western lines differ morphologically, they inhabit different environments, and are also adapted to various climatic conditions. The wapiti deer are better adapted to cool, boreal climate. They live in the central, eastern and southern Asia and in the North America. The European deer are associated with warmer climatic conditions and inhabiting areas of temperate and Mediterranean zones. Their natural range covers Europe, the Middle East and the North Africa. Since the Late Pleistocene until today the range of red deer has changed in response to climate oscillations, generally decreasing in cooler periods and expanding in warmer periods. The species range was at its minimum in the period of 18-26 000 years ago, during the Last Glacial Maximum. Red deer survived this period in glacial refugia in the Iberian, Apennine and Balkan Peninsulas, in the western part of Europe, as well as in the Carpathians, in the vicinity of the Black Sea and the Urals. After the glacier retreat and during the climate warming in the Holocene, the species recolonised large areas of the continent. Previous studies of stable carbon and nitrogen isotopes indicated that analyses of their composition allow to i.e. reveal the environmental conditions in which these animals foraged. In palaeoecological studies bones are used for isotopic analyses, however, the amount of available material is usually limited. In addition, in such studies stable isotopic values of different parts of the skeleton and individuals of different age and sex are analysed collectively. Until now, there was no sufficient data confirming that the results of analyses of such diversified material are comparable. In addition, no studies analysed in a complex way, which of the climatic and environmental factors explain the 13C and 15N variability in the bone collagen of modern red deer. Such data are crucial to reveal feeding habitats of red deer in the past. The main aims of my thesis were: (Publication 1) to compare the stable isotope values of carbon (13C) and nitrogen (15N) in bone collagen at the intraindividual (among different parts of the same bone, different bones of the same individuals) and intrapopulation (between males and females, and among individuals of different age within the same populations), as well as interpopulation levels of modern free-ranging red deer from European populations inhabiting various environments; (Publication 2) to investigate, which of the environmental factors affect most significantly the 13C and 15N values in bone collagen of modern red deer from the European populations; (Publication 3) to investigate, with the application of analyses of carbon and nitrogen stable isotope composition in bone collagen, whether and how the feeding habitat of the red deer (Cervus elaphus) changed in Eurasia over the last 50 000 years; to check whether the feeding habitats differed among deer belonging to different phylogenetic lineages and mitochondrial DNA (mtDNA) haplogroups; and to indicate, which of the analysed environmental factors determined most significantly the stable isotope composition of European red deer bone collagen in the Holocene. I hypothesized that: 1) isotopic composition of carbon 13C and nitrogen 15N were influenced by the type of bone, sex and age of sampled individual and habitat conditions, where the individual used to feed (Publication 1); 2) among analysed environmental factors: the proportion of forest cover (described further in the text as the forest cover), the annual precipitation, the mean January temperature and the altitude (a.s.l.) and distance to the seashore in coastal habitats affected most significantly the 13C and 15N values in red deer bones (Publication 2); 3) red deer shifted their feeding habitats in space and in time according to climatic and environmental changes in Eurasia over the last 50 000 years (Publication 3); 4) feeding habitats varied among individuals belonging to different phylogenetic lineages and mitochondrial DNA (mtDNA) haplogroups (Publication 3); 5) forest cover, temperature, precipitation and altitude a.s.l. best explained the variability of stable carbon and nitrogen isotope composition of bone collagen in European red deer in the Holocene (Publication 3). To investigate the intraindividual and intrapopulation variability I used 322 bone samples collected mostly in years 2007 - 2018 in Poland, Slovenia and Great Britain (Scotland). In this study I compared carbon and nitrogen stable carbon and nitrogen isotope composition among: different parts of the same bone (mandible), bones from various fragments of the skeleton of the same individuals (mandibles, phalanges, metatarsals) and bones of deer of different sexes and ages from the same populations (Publication 1). To analyse interpopulation variability I used 242 bone samples of individuals from 15 localities (in Poland, Slovenia, Scotland and the Netherlands) collected mostly in years 2007 -2019. The localities varied in geographic location, topography and forest cover. They included various habitats: densely forested areas and areas with low forest cover as well, mosaic of forests and arable grounds, open areas, mountains, lowlands, and coastal areas. I investigated which of the environmental factors (forest cover, the altitude a.s.l., the annual precipitation, the mean annual temperature, the mean temperatures of January and July) affected the variability in stable isotope composition of carbon 13C and nitrogen 15N in bone collagen of red deer from various localities (Publication 2). To compare variability in stable isotope composition of carbon 13C and nitrogen 15N in bone collagen of ancient and modern red deer, I used 49 randomly selected samples from the set of modern samples analysed in previous studies and 74 radiocarbon-dated ancient samples from the last 50 000 years from different areas of Eurasia. These samples, based on previous studies, were assigned to one of two lines: the European deer or the wapiti and their mtDNA haplogroups. Additionally, I extended the analysed sample set with literature data (478 samples) dated to the last 50 000 years from Europe. I used the entire collected material to check, how the feeding habitats of red deer changed from the Late Pleistocene until modern times. In addition, I analysed which of the selected factors (the radiocarbon age of the sample, the mtDNA haplogroup, the mean annual temperature, the mean temperatures of January and July, the annual precipitation, the January and July precipitation, altitude a.s.l., biome, forest cover) affected the variability of 13C or 15N values in bone collagen of European red deer dated to the Holocene (Publication 3). Through the analysis of intraindividual variability, I revealed high correlation of the stable isotopes 13C and 15N values of bones from various parts of the red deer skeleton (phalanx I and mandible). Additionally, I revealed high correlation of the stable isotopes 13C and 15N values of among pairs of long bones of the same individuals (phalanx I, phalanx II, metatarsus) and among pairs of three different fragments of the same mandibles (a corpus, an angle, a notch). Through the analysis of intrapopulation variability I did not find any relationship between both carbon and nitrogen stable isotope composition and the age and sex of the studied individuals. The obtained results allowed me to reject previously proposed hypotheses regarding intraindividual and intrapopulation variability (Publication 1). Through the analysis of interpopulation variability, I detected the lowest stable isotope 13C values in bones of individuals from forested mountainous areas, while the highest values in bones of deer from open areas. I observed the lowest 15N values in bones of individuals from forested mountainous areas, while the highest values in bones of deer from open coastal areas (Publication 2). I revealed that the factor that best explained the variability of the carbon stable isotope 13C in the bone collagen of modern deer was the forest cover. The variability of the nitrogen stable isotope 15N of modern red deer bones was best explained by proportion of open areas. Additionally, I showed that the values of the 15N stable isotope of red deer inhabiting coastal areas decreased with distance from the sea. The obtained results allowed me to accept previously proposed hypotheses regarding the influence of feeding habitat of red deer on isotopic composition of carbon 13C and nitrogen 15N in their bone collagen (Publication 2). I showed that over the last 50 000 years red deer feeding habitats in Eurasia changed according to environmental oscillations (e.g. forest expansion related to climate warming), and also in response to landscape changes associated with human activity (i.e. deforestation and the spread of agriculture). Comparing the isotopic composition of carbon 13C and nitrogen 15N in bone collagen of modern and ancient deer, I showed significant differences between them, especially in the case of the 13C isotope. Among all analyzed individuals in the last 50 000 years (including the literature data) the lowest values of the 13C isotope was recorded in the modern deer. This is probably due to the fact that most modern red deer inhabit the most densely forested areas compared to individuals that lived in the past in the last 50 000 years (Publication 3). Based on the conducted analyses, I found that during the Late Pleistocene European the red deer values of stable isotopes carbon 13C and nitrogen 15N were in the range of such values obtained for wapiti deer. While during the Holocene wapiti deer values of 13C and 15N were in the range of these values of European red deer. This probably indicate that the feeding habitats of the red deer belonging to these two phylogenetic lineages were similar (Publication 3). In the next step of the research, I showed that the variability of isotope 13C in the Holocene red deer was best explained by the forest cover and the mean July temperature. The variability of nitrogen isotope 15N was best explained by the annual precipitation, the mean July temperature and the altitude a.s.l. (Publication 3). To sum up, on the basis of the analysis of bone samples of modern deer, I found that palaeoecological studies using the stable isotope analysis of 13C carbon and 15N nitrogen can be conducted with the use of various bones of the skeleton, without taking into account the sex and age of the individuals (excluding fawns that feed on mother's milk). I showed that the most important factor shaping the isotopic composition of carbon 13C was the forest cover and of nitrogen 15N - the percentage share of open areas. Most significant factors, which affected carbon stable isotope composition in the Holocene were, similarly to modern samples, forest cover and additionally the mean July temperature. In case of nitrogen stable isotope composition, most important factors were the annual precipitation, the mean July temperature and the altitude a.s.l.. During the Late Pleistocene and Holocene in Europe and Asia, feeding habitats of red deer changed according to environmental oscillations.