Identyfikacja białek wiążących modyfikowane potranslacyjne histony u Arabiodopsis thaliana (L.) Heynh

Chromatyna jest niezwykle dynamiczną strukturą, która odgrywa kluczową rolę w wielu procesach zachodzących na poziomie DNA w jądrze komórki eukariotycznej. Jej reorganizacja ma miejsce w szczególności w trakcie ekspresji genów, replikacji, naprawy i rekombinacji DNA. Jednym z głównych mechanizmów odpowiedzialnych za regulacje tej struktury są potranslacyjne modyfikacje histonów. Okazuje się, że określone modyfikacje potranslacyjne histonów mogą kontrolować wiązanie specyficznych białek i kompleksów białkowych do chromatyny, a tym samym wpływać na jej stan. Takie obserwacje doprowadziły do powstania hipotezy tzw. kodu histonowego. Hipoteza ta opiera się na współdziałaniu białek enzymatycznych zdolnych do „nanoszenia” i „usuwania” kodu, czyli wprowadzających lub usuwających odpowiednie modyfikacje chemiczne w obrębie aminokwasów zlokalizowanych zazwyczaj w nieustrukturyzowanych domenach końcowych histonów rdzeniowych (tzw. ogonów histonowych). Bardzo ważne są jednak białka „rozpoznające” kod, czyli specyficznie wiążące odpowiednio zmodyfikowany histon. Co więcej, niektóre z takich białek mogą dodatkowo rekrutować do chromatyny inne białka niehistonowe (np. elementy ATP-zależnych kompleksów remodelujących chromatynę). Można je wtedy określić jako białka „platformy”. Za właściwe rozpoznawanie powyższego kodu odpowiedzialne są białka zawierające specyficzne domeny. Wyszukiwanie i identyfikowanie takich białek jest niezbędne do zrozumienia mechanizmu regulacji epigenetycznej opartej na modyfikacjach potranslacyjnych histonów. Wspomniany system regulacji okazuje się jednak zdecydowanie bardziej złożony, niż początkowo sądzono. Różne modyfikacje potranslacyjne histonów mogą nie tylko współdziałać w przyłączaniu właściwych białek, ale także oddziaływać w sposób uniemożliwiający ich wiązanie. Z każdym rokiem nasza wiedza o rodzajach modyfikacji potranslacyjnych jest coraz bardziej rozległa. Łącznie, z najlepiej do tej pory poznanymi – metylacją, acetylacją, fosforylacją – znanych jest ich obecnie ponad 20 rodzajów. Tak więc poziom skomplikowania kodu, wynikający z możliwych kombinacji (wzorów) współwystępujących modyfikacji w obrębie jednego ogona histonu, jest ogromny. Głównym celem mojej pracy było zidentyfikowanie białek jądrowych, które wiążą się do fosfoacetylowanego (S10PK14Ac) histonu rdzeniowego H3, a tym samym są zaangażowane w regulację ekspresji genów Arabidopsis thaliana w odpowiedzi na stresy abiotyczne. Zastosowane podejście eksperymentalne pozwoliło na identyfikację dwunastu białek, które potencjalnie oddziałują z tak modyfikowanym histonem. W rezultacie dalszych badań wytypowałem białko AtCWC22, oddziałujące bezpośrednio in vitro z peptydem będącym analogiem histonu H3 z wprowadzonymi modyfikacjami S10PK14Ac. AtCWC22 może odgrywać rolę tzw. białka platformy, stanowi bowiem element potencjalnego wielopodjednostkowego kompleksu, składającego się ze zidentyfikowanych w eksperymencie białek. Większość z tych białek najprawdopodobniej jest zaangażowana w procesy transkrypcji oraz splicingu. Na podstawie uzyskanych wyników oraz danych literaturowych proponuję następujący model, który określa rolę białka AtCWC22 u Arabidopsis: AtCWC22, wiążąc się do fosfoacetylowanego histonu może uczestniczyć zarówno w kontrolowaniu przebiegu transkrypcji określonych genów, jak i ustalaniu miejsc splicingowych w obrębie powstających transkryptów co wpływa na regulację ekspresji genów.

Chromatin is a dynamic structure that plays a crucial role in many diverse processes occurring at the DNA level. Reorganization of chromatin occurs especially during gene expression, replication, DNA repair and recombination. One of the major mechanisms regulating this structure are post-translational modifications of histones. According to the histone code, the specific pattern of histone post-translational modifications controls the binding of specific proteins and protein complexes to chromatin, thus determining its status. The hypothesis of histone code is based on the interaction between enzymes capable of "marking" the code by introducing or removing appropriate modifications in certain locations (usually within so called histone tails), and proteins that "recognize" the code by specific binding with an adequately modified histone and serves as a platform for other non-histone proteins (for example ATP-dependent chromatin remodeling complexes), mediating the implementation of "coded" process. Proteins with defined domains are responsible for specific recognition of the above code. Finding and identifying these proteins is crucial for understanding the mechanisms of epigenetic regulation. The above mentioned regulation system is much more complicated than we previously thought. Various modifications may not only cooperate in the attachment of appropriate proteins, but also prevent bindings. Each year our knowledge about types of histone post-translational modifications is growing. Together with the best known – methylation, acetylation, phosphorylation - so far we are aware about more than 20 types of histones post-translational modifications. Thus, the level of code complexity resulting from the possible combinations (patterns) of co-occurring modifications within one histone tail is enormous. The main aim of my work was to identify proteins that specifically binds to phosphoacetylated H3 histone (H3S10PK14Ac) and which are involeved in regulation of genes responsive to abiotic stresses in Arabidopsis thaliana. The applied experimental approach allowed me to identify twelve proteins that potentially interact with the phosphoacetylated histone. As a result of further research, I have established that the AtCWC22 protein interacts directly in vitro with the peptide which is an analog of H3 histone with the introduced modifications S10PK14Ac. Moreover, AtCWC22 probably is able to recruit other non-histone proteins, also identified in above mentioned experiment, and may be a part of the potential multi-subunit complex, which I attempted to characterize in general. Most of the twelve identified proteins are possibly involved in the transcription and splicing. Based on the obtained results and literature data, I can propose the following model that determines the role of the AtCWC22 protein in Arabidopsis. AtCWC22 which binds to phosphoacetylated histone may be responsible not only for determining the course of transcription of specific genes, but also for the selection of splice sites within the transcripts. Thereby may affect the outcome of genes expression.