Mechanistyczne oraz ewolucyjne aspekty oddziaływania drożdżowych białek PPR z transkryptami mitochondrialnymi na przykładzie białka Dmr1

Mitochondria wszystkich współcześnie występujących eukariontów tworzą grupę monofiletyczną, zakorzenioną w klasie α proteobakterii. Pomimo bardzo znacznej redukcji genomu, mitochondria zachowują odrębny system transkrypcyjny i translacyjny. Znaczna część regulacji ekspresji kodowanych mitochondrialnie białek odbywa się na etapie posttranskrypcyjnym, na którym istotną rolę odgrywają białka wiążące RNA.Białka z rodziny PPR charakteryzują się tandemowo powtórzonymi, 35 cio aminokwasowymi motywami. Białka PPR lokalizują się niemal wyłącznie w organellach (mitochondriach i plastydach), gdzie odpowiadają za stabilizację, redagowanie, obróbkę bądź degradację transkryptów lub aktywację translacji. Szczególnie uderzająca jest znaczna ekspansja rodziny PPR u roślin naczyniowych, gdzie pojedynczy genom może kodować od kilkuset do ponad tysiąca białek PPR. Roślinne białka PPR wiążą docelowe RNA w sposób modularny, gdzie pojedynczy motyw odpowiada za rozpoznawanie pojedynczego nukleotydu, a specyficzność wiązania determinowana jest głównie przez dwie pozycje aminokwasowe w obrębie motywu. U organizmów nieroślinnych liczba białek PPR przeważnie nie przekracza kilkunastu w konkretnym gatunku.Drożdżowe, kodowane jądrowo białko Dmr1 lokalizuje się do mitochondriów i należy do rodziny białek PPR. Jego delecja powoduje utratę zdolności oddechowych i destabilizację mtDNA oraz powstanie specyficznego wzoru degradacji 15S rRNA. Doświadczenia in vitro potwierdziły specyficzność oddziaływania Dmr1p z 15S rRNA w przynajmniej trzech pozycjach. Precyzyjniejsze mapowanie na drodze koprecypitacji RNA z białkiem oraz dalsze doświadczenia typu EMSA i ochrony przed RNazami potwierdziły, że Dmr1p specyficznie wiąże monotonną, 14 to nukleotydową sekwencję powtarzającą się w obrębie cząsteczki 15S rRNA. Porównanie sekwencji rRNA oraz konserwacji funkcji ortologów pomiędzy różnymi gatunkami drożdży poparły powyższe wyniki, a analiza bioinformatyczna pozwoliła stwierdzić, że mechanizm rozpoznawania sekwencji RNA u drożdży jest zbliżony do roślinnego, choć mniej jednoznaczny.

Mitochondria of all extant eukaryotes form a monophyletic group that is rooted within the α-proteobacteria class. Despite a strongly reduced genome, mitochondria retain an independent transcription and translation machinery. Much of the regulation of expression of mitochondrially-encoded proteins takes place at the post-transcriptional phase, where RNA binding proteins play a significant role.PPR proteins are distinguished by the presence of tandem 35 amino acid motifs. PPR proteins localize almost exclusively to organelles (mitochondria and plastids), where they participate in stabilizing, editing, processing or degradation of transcripts as well as in translation activation. The expansion of PPR family in land plants is particularly striking. A single land plant genome can encode from several hundred up to over a thousand PPR proteins. PPR proteins in plants bind their target RNA in a modular manner, where an individual motif binds an individual nucleotide. The specificity of binding is mainly determined by two amino acid positions within the motif. Among non-plant organisms the number of PPR proteins usually does not exceed about a dozen per species. The yeast nuclear-encoded Dmr1 protein locates to mitochondria and belongs to the PPR family. Deletion of DMR1 gene leads to the loss of respiratory function, destabilization of mtDNA, as well as a specific 15SrRNA degradation pattern. In vitro experiments have confirmed the specificity of Dmr1p binding in at least three position within 15S rRNA molecule. Fine mapping of the binding positions by RNA pull-down, followed by EMSA and RNase footprinting experiments demonstrated that Dmr1p specifically binds a monotonous 14-nucleotide sequence within 15S rRNA. Comparison of sequences and functional conservation of Dmr1p orthologues from different yeast species supported these results and a bioinformatic analysis indicated that the mechanism of sequence recognition in yeast is similar to that in land plant, albeit less clear-cut.