Non-Structural Protein 2 of Human Respiratory Syncytial Virus as a Driver of Epithelial Inflammation and Immune Reprogramming.

Ludzki syncytialny wirus oddechowy (hRSV) wykorzystuje białko niestrukturalne NS2 jako istotny czynnik modulujący odpowiedź gospodarza i nasilający stan zapalny w nabłonku dróg oddechowych, co czyni NS2 obiecującym celem strategii immunomodulacyjnych. W pierwszym etapie badań, których wyniki opisano w niniejszej rozprawie, wykazano, że komórki A549 eksprymujące NS2 wytwarzają istotnie wyższe poziomy IL-6 i IL-8 niż komórki kontrolne. Analiza ekspresji genów (RT-qPCR) wykazała, że stabilna ekspresja NS2 wyraźnie podnosi poziomy transkryptów IL-1β, IL-6 i CXCL8 oraz w niewielkim stopniu zwiększa transkrypcję TNF-α. W nadsączach zebranych z hodowli komórek nabłonkowych zawierających gen ns2, również wykryto zwiększoną ilość IL-6 i CXCL8 w porównaniu do komórek kontrolnych (odpowiednio 8- i 56-krotnie więcej). Zebrane dane wskazują na selektywną, niezależną od interferonu odpowiedź zapalną, indukowaną przez aktywność NS2. Główne składniki czynnika transkrypcyjnego NF-κB (NFKB1, NFKBIA) nie ulegają istotnym zmianom na poziomie ekspresji genów w komórkach nabłonkowych z genem ns2 w porównaniu do komórek kontrolnych. Obecność białka NS2 w komórkach zwiększa jednak ekspresję podjednostki FosB czynnika transkrypcyjnego AP-1 oraz długiego niekodującego RNA MALAT1. Zmiany te mogą wskazywać na zaangażowanie białka NS2 w związaną z AP-1 oraz MALAT1 regulację cytokin. Ekspresja NS2 w komórkach nabłonkowych A549 prowadzi także do produkcji rozpuszczalnych czynników prozapalnych, które w warunkach ko-kultury parakrynnie modulują sąsiednie komórki nabłonkowe niezawierające genu ns2. Zaobserwowano indukcję IL-1β (>100-krotnie zwiększona ekspresja), CXCL8 oraz MALAT1 (~20-krotny wzrost ekspresji) oraz obniżenie ekspresji FosB w komórkach A549 współhodowanych z A549/NS2. Wyniki te wskazują, że czynniki rozpuszczane wydzielane przez komórki nabłonkowe zawierające NS2 przenoszą sygnał zapalny indukowany przez NS2, częściowo odtwarzając fenotyp komórek z ekspresją NS2. Analiza TEM komórek A549/NS2 ujawnia powiększone, wydłużone mitochondria o mniej wyraźnych grzebieniach, ogniskowe poszerzenia siateczki śródplazmatycznej oraz wzmożoną pęcherzykowatość. Badanie ekspresji genów związanych z homeostazą mitochondrialną (IMMT1, LETM1, PHB2, OPA1, ATAD3, BAX, CIAP) nie wykazało istotnych zmian transkrypcyjnych, co sugeruje, że przebudowa organelli zachodzi post-transkrypcyjnie lub poprzez oddziaływania strukturalne. Ko-hodowla makrofagów różnicowanych z THP-1 z komórkami A549/NS2 generuje fenotyp charakteryzujący się obniżoną ekspresją CD11b, CD14, CD86 i CD40 oraz zwiększoną ekspresją CD163, CD206, IL10, MCSF i ARG2. Dane transkrypcyjne potwierdzają ten kierunek zmian: IL10, MCSF i ARG2 są podwyższone, natomiast markery prozapalne, takie jak TNFα i IL12p70, pozostają obniżone. Połączenie profilu markerów powierzchniowych i ekspresji genów odpowiada stanowi makrofagów o charakterze regulacyjnym, zbliżonym do fenotypu M2c. Kontakt komórek nabłonkowych z limfocytami T modyfikuje glikozylację pomocniczych limfocytów CD4⁺, regulatorowych CD4⁺ oraz cytotoksycznych CD8⁺, zwiększając sylilację oraz zmniejszając 6 fukozylację i glikozylację O-zależną. Ekspresja NS2 dodatkowo pogłębia redukcję O-zależnych glikanów na limfocytach regulatorowych, co może osłabiać ich funkcję supresyjną. Ponadto NS2 zmniejsza odsetek cytotoksycznych limfocytów T CD25⁺CD69⁺, wskazując na podwyższenie progu ich aktywacji. Zebrane dane wskazują na rolę NS2 w selektywnej modulacji produkcji cytokin nabłonkowych, architekturze organelli oraz fenotypie komórek odpornościowych. Wszystkie te czynniki tworzą środowisko prozapalne o ograniczonej skuteczności eliminacji wirusa. Wyniki te dostarczają mechanistycznych podstaw patogenezy RSV i wskazują szlaki zależne od NS2 jako potencjalne cele terapeutyczne.

Human respiratory syncytial virus (hRSV) utilizes the non-structural protein NS2 as a principal driver of epithelial inflammation, making NS2 a more promising target for immunomodulatory strategies than NS1. First, it was shown that NS2-expressing A549 epithelial cells produce substantially higher levels of IL-6 and IL-8 indicating a stronger capacity to stimulate immune pathways. Gene-expression analysis (RT-qPCR) demonstrated that stable NS2 expression markedly up-regulates IL-1Β, IL-6 and CXCL8 transcripts, modestly increases TNFα transcription. Protein secretion, assessed by cytometric bead array (CBA), confirming that NS2-expressing cells secrete IL-6 ( 8-fold increase) and CXCL8 (≈56-fold increase) into the culture medium, while TNF-α secretion remains unchanged. These results delineate a selective, non-interferon inflammatory response driven principally by NS2. Additionally, NS2 elevates transcription factor AP-1 subunit FosB (3-fold) and the long non-coding RNA MALAT1 ( 3.3-fold). NF-κB core components (NFKB1, NFKBIA) are not significantly altered in cells with ns2 gene, implicating a connection of ns2 with an AP-1-MALAT1 axis in the observed cytokine up-regulation. Co-culture experiments with NS2-expressing and parental A549 epithelial cells demonstrated that NS2-expressing epithelial cells trigger paracrine amplification of pro-inflammatory cytokine production in parental epithelial cells. The latter cells exposed to NS2-expressing epithelial cells showed a strong secondary up-regulation of IL-1Β (> 100-fold) and MALAT1 (≈ 20-fold), a modest increase in IL8, and a reduction in FosB expression, demonstrating that soluble factors disseminate the NS2-driven inflammatory signal. Transmission electron microscopy of NS2-expressing epithelial cells reveals enlarged, elongated mitochondria with less defined cristae, focal dilation of the endoplasmic reticulum, and increased vesiculation. Quantitative PCR of mitochondrial-homeostasis genes (IMMT1, LETM1, PHB2, OPA1, ATAD3, BAX, CIAP) shows no significant transcriptional changes, suggesting that organelle remodeling is mediated post-transcriptionally or via structural interactions. Co-culture of THP-1-derived macrophages with NS2-expressing epithelial cells produces a phenotype characterized by decreased CD11b, CD14, CD86, and CD40 expression and increased CD163, CD206, IL10, MCSF, and ARG2. Gene-expression data corroborate this shift: IL10, MCSF, and ARG2 are up-regulated, while pro-inflammatory markers such as TNFα and IL12p70 are suppressed. The combined surface-marker and transcriptional signature aligns with an M2c-like, regulatory macrophage state. Interaction with NS2-expressing epithelial cells modifies glycosylation on CD4⁺ helper, CD4⁺ regulatory, and CD8⁺ cytotoxic T cells, increasing sialylation and decreasing fucosylation and O-linked glycosylation. NS2 expression specifically deepens the reduction of O-linked glycans on regulatory T cells, potentially weakening their suppressive function. Additionally, NS2 reduces the proportion of CD25⁺CD69⁺ cytotoxic T cells, indicating an elevated activation threshold. 8 Collectively, NS2 functions as a selective modulator of epithelial cytokine production, organelle architecture, and immune-cell phenotype, establishing a pro-inflammatory environment that is inefficient at antiviral clearance. These findings provide a mechanistic framework for hRSV pathology and identify NS2-centered pathways as potential therapeutic targets.