Rola sygnałów aktywacyjnych i cytokin w powstawaniu in vitro pochodzących z grasicy limfocytów T regulatorowych

Pochodzące z grasicy limfocyty T regulatorowe (tTreg, ang. thymus-derived regulatory T cells) o fenotypie CD4+CD25+Foxp3+ odgrywają ważną rolę w utrzymaniu tolerancji immunologicznej. Różnorodne czynniki zaangażowane w ich powstawanie i funkcje biologiczne są ciągle przedmiotem badań, które są szczególnie trudne ze względu na niewielką liczbę tych komórek w organizmie oraz ich dużą wrażliwość na indukcję apoptozy in vitro. Celem niniejszej pracy było opracowanie optymalnych warunków hodowli in vitro, umożliwiających badanie rozwoju limfocytów tTreg oraz możliwych mechanizmów ich powstawania z niesortowanych tymocytów, ze szczególnym uwzględnieniem roli sygnałów aktywacyjnych i cytokin. Wykazano, że metody używane standardowo do uzyskiwania limfocytów T regulatorowych w drodze indukcji z aktywowanych naiwnych limfocytów T izolowanych z obwodowych narządów limfoidalnych są nieprzydatne w badaniu rozwoju limfocytów Treg powstających w grasicy. W pracy przedstawiono opracowany nowy model hodowli tymocytów oparty o powszechnie uznawany dwuetapowy szlak rozwoju limfocytów tTreg. W pierwszym etapie powstawanie limfocytów tTreg zależne jest od silnego sygnału aktywacji z udziałem receptora limfocytów T (TCR) i sygnału kostymulacyjnego od cząsteczki CD28, a w drugim etapie - od cytokin. W grasicy, sygnał do TCR dostarczany jest przez kompleks MHC II/ własny peptyd korowych komórek nabłonkowych grasicy, który w opracowanym modelu zastąpiony został przez użycie przeciwciał monoklonalnych anty-CD3. Jako źródło sygnału dostarczanego do CD28 wykorzystano cząsteczki kostymulatorowe ulegające ekspresji na komórkach prezentujących antygen, w roli których użyto niedojrzałe komórki dendrytyczne linii JAWS II. Nowy model hodowli tymocytów in vitro umożliwił skuteczne uzyskiwanie funkcjonalnych limfocytów tTreg w hodowli niesortowanych tymocytów. Wykazano, że efektywne uzyskiwanie limfocytów tTreg z niesortowanych tymocytów występujących fizjologicznie w grasicy wymaga obecności komórek prezentujących antygen oraz silnego sygnału aktywacji z udziałem kompleksu TCR/CD3. Obecność komórek dendrytycznych sprzyja powstawaniu tymocytów SP CD4+ oraz zapewnia dużą żywotność tymocytów w hodowli wskutek endocytozy komórek apoptotycznych. Dostarczenie tymocytom silnego sygnału aktywacji z udziałem kompleksu TCR/CD3 sprzyja ich ukierunkowanemu rozwojowi in vitro w limfocyty tTreg. Zbadano rolę wybranych cytokin w generowaniu limfocytów Treg in vitro. Wykazano, iż w rozwoju limfocytów tTreg w opracowanym modelu hodowli ważną rolę odgrywają nie pojedyncze cytokiny, lecz ich określony zestaw, którego zastosowanie w hodowli tymocytów wpływa na efektywność uzyskiwania dojrzałych limfocytów tTreg. Dużą skuteczność w powstawaniu limfocytów tTreg in vitro wykazały IL-7 i TGF-β. Stworzone warunki umożliwiły powstawanie limfocytów tTreg zarówno z komórek prekursorowych, jak również w drodze indukcji w mikrośrodowisku cytokinowym. Uzyskane in vitro limfocyty tTreg zachowały aktywność supresyjną, a mechanizm ich działania nie był zależny od wydzielanych cytokin supresorowych: IL-10 i TGF-β. Opracowany model hodowli wykorzystano w badaniach wpływu glukokortykoidów na rozwój limfocytów tTreg in vitro. Potwierdzono rolę glukokortykoidów jako czynnika selekcyjnego w rozwoju limfocytów tTreg wskutek bezpośredniego działania na tymocyty (zróżnicowana wrażliwość tymocytów na indukcję apoptozy) oraz pośredniego na komórki prezentujące antygen (modulowanie ekspresji cząsteczek kostymulatorowych). Potwierdzono użyteczność opracowanego modelu hodowli do generowania in vitro limfocytów tTreg myszy starych. W oparciu o udowodnioną użyteczność opracowanego modelu hodowli zasugerowano jego potencjalną przydatność do badania roli różnych czynników w powstawaniu i funkcji limfocytów tTreg, będących aktualnie obiektem intensywnego zainteresowania w kontekście wdrażanych nowych terapii opartych o limfocyty Treg.

Thymus-derived regulatory T cells (tTregs) of CD4+CD25+Foxp3+ phenotype play an important role in maintaining immune tolerance. Distinct factors involved in their generation and biological functions are still the subject of research. Due to the small number of these cells in the body and their high sensitivity to the induction of apoptosis in vitro, research on factors affecting their development is highly difficult. The aim of this study was to develop optimal conditions for in vitro culture, to enable the study on tTreg development from unsorted thymocytes, with particular attention on the role of activation signals and cytokines in the generation of these cells. The methods used as standard for obtaining regulatory T cells by induction from activated naive T cells isolated from peripheral lymphoid organs are not useful in studying the development of thymus-derived Tregs. Within the study the new in vitro culture model has been developed based on the widely recognized two-stage tTreg development pathway. The first step of tTreg development is dependent on a strong signal provided by T cell receptor (TCR) and a co-stimulatory signal by CD28 molecule, the second stage is dependent on cytokines. In the thymus, the signal for TCR is delivered by MHC II/self-peptide complexes of cortical thymic epithelial cells, which has been replaced in presented model by the use of anti-CD3 monoclonal antibodies. As the source for the CD28 signal, costimulatory molecules of JAWS II immature dendritic cells have been used. The new culture model allowed the generation of functional tTregs from unsorted thymocytes. It has been confirmed that efficient generation of tTregs in vitro from unsorted thymocytes occurring physiologically in the thymus requires antigen presenting cell-thymocyte contact and strong signal to the TCR/CD3 complex. Dendritic cells contact promotes generation of SP CD4+ and provides high viability of thymocytes in culture due to endocytosis of apoptotic cells by JAWS II cells. Strong signal to the TCR/CD3 complex provides lineage commitment of precursors cells into tTregs in vitro. The role of selected cytokines in the generation of Tregs in vitro was examined. It has been shown that during tTreg development, not only single cytokines play an important role, but their set, which supplementation in vitro affects the efficiency of tTreg generation. IL-7 and TGF-β have been shown to be highly effective in the development of tTregs in vitro. Created conditions enabled the generation of tTreg cells from both precursor cells as well as by induction under cytokine microenvironment. The suppressive activity of generated in vitro tTregs has been maintained, while the mechanism of their action was not dependent on secreted suppressor cytokines: IL-10 and TGF-β. The new model has been utilized to conduct studies on the effect of glucocorticoids on the development of tTregs. The role of glucocorticoids as selective factor in tTreg development has been confirmed acting directly on thymocytes (by differentiated sensitivity of thymocytes to glucocorticoids-induced apoptosis) and indirectly on antigen presenting cells (by modulating the expression of costimulatory molecules on their surface). The utility of the developed model for in vitro generation of tTregs of old mice was confirmed. Based on the proven utility of the developed culture model, it has been suggested as a potential research tool for the studies on the role of distinct factors in generation and function of tTreg, including pilot studies for new therapies based on Treg to be developed nowadays.