Badanie możliwości wykorzystania produktów ubocznego użytkowania lasu jako źródła antyutleniaczy

Produkty ubocznego użytkowania lasu to surowce lub produkty niedrzewne, do których zalicza się: produkty pochodzenia roślinnego (owoce leśne, rośliny lecznicze, przemysłowe i dekoracyjne, korę, żywicę i inne wydzieliny drzew), produkty pochodzenia zwierzęcego (produkty łowiectwa, ślimaki, miód i wosk), grzyby jadalne oraz kopaliny (minerały, torf, piasek, żwir). Leśne użytki niedrzewne były od wieków wykorzystywane przez ludzi jako pożywienie oraz środki lecznicze stosowane w medycynie ludowej. W Polsce silnie zakorzeniona jest tradycja zbierania grzybów i owoców leśnych na własny użytek. W pracy zbadałam próbki roślin leśnych, takich jak: wrzos zwyczajny (Callunavulgaris L.), borówka czernica (Vaccinium myrtillus L.), borówka brusznica (Vaccinium vitis-idaea L.), kora sosny pospolitej (Pinu silvestris L.) oraz kora dębu (Quercus robur L.), które pobrałam z terenu Mazowsza. Polifenole, wraz z karotenoidami, tokoferolami i witaminą C, zaliczane są do naturalnych składników żywności o charakterze przeciwutleniaczy, czyli związków, które mają zdolność do wstrzymania lub spowalniania procesu utleniania danej substancji. Ich aktywność przeciwutleniająca wiąże się z pierścieniową budową cząsteczki mającej sprzężone wiązania podwójne, jak i z obecnością grup hydroksylowych w tych pierścieniach. Związki polifenolowe to wtórne metabolity roślin, do których zaliczane są: flawonoidy, kwasy fenolowe (pochodne kwasu benzoesowego i cynamonowego), antocyjany, stilbeny, lignany i taniny. Działanie przeciwutleniające związków polifenolowych polega na eliminowaniu reaktywnych form tlenu, neutralizacji wolnych rodników, inhibicji enzymów z grupy oksydaz oraz chelatowaniu jonów metali. W rozprawie doktorskiej badałam właściwości antyutleniające wybranych produktów ubocznego użytkowania lasu oraz ich skład chemiczny, zwłaszcza pod kątem zawartości związków polifenolowych. Ponadto porównałam efektywność ekstrakcji polifenoli w zależności od rodzaju użytego rozpuszczalnika, temperatury i czasu ekstrakcji. Do ekstrakcji zastosowałam wodę destylowaną, mieszaninę wody i etanolu (40/60, v/v) oraz octan etylu. Dodatkowo sprawdziłam efektywność ekstrakcji z użyciem cieczy jonowych: chlorku 1-butylo-3-metyloimidazoliowego, tetrafluoroboranu 1-butylo-3-metyloimidazoliowego, heksafluorofosforanu 1-butylo-3-metyloimidazoliowego. Oznaczyłam właściwości redukujące za pomocą metody Folina- Ciocalteu i metody CUPRAC, natomiast zdolność do neutralizacji wolnych rodników zbadałam przy użyciu rodnika DPPH˙. Całkowitą zawartość antocyjanów oznaczyłam przy użyciu różnicowej metody pH, zaś flawonoidów za pomocą metody z jonami Al(III). Technika chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas posłużyła mi do wyznaczenia zawartości wybranych związków polifenolowych w badanych ekstraktach. Zawartość wybranych makro i mikroelementów oznaczyłam techniką ICP-OES. Kwiaty wrzosu są bogatym źródłem kwasu chlorogenowego, ferulowego i p-hydroksybenzoesowego, a także flawonoidów, w tym katechiny, epikatechiny, kwercetyny, kwercetryny oraz apigeniny. Najwięcej w ekstraktach wrzosowych jest kwasu chlorogenowego, ponad 1 mg/g. Analiza chromatograficzna wykazała obecność w ekstraktach z kwiatów wrzosu tricetinu (5,7,3’,4’,5’-pentahydroksy flawonu), który nie został do tej pory zidentyfikowany we wrzosie i który występuje w największym stężeniu w kwiatach wrzosu leśnego. Wrzosy leśne charakteryzują się większą różnorodnością polifenoli, zwłaszcza w porównaniu do białej odmiany ogrodowej. Najwyższe efektywności procesu ekstrakcji związków polifenolowych uzyskałam przy użyciu cieczy jonowych, 60% roztworu etanolu oraz octanu etylu. Także podniesienie temperatury ekstrakcji do 55°C spowodowało wzrost jej efektywności. Najwyższe wyniki dla całkowitej zawartości flawonoidów i antocyjanów uzyskałam dla wodno-etanolowych (40/60, v/v) ekstraktów z fioletowych kwiatów wrzosu ogrodowego oraz z kwiatów wrzosu zebranych z terenu Nadleśnictwa Wyszków. Wrzosy te charakteryzowały się także najwyższymi właściwościami redukującymi oraz najsilniejszymi zdolnościami do neutralizacji rodników DPPH˙.Wrzos, zarówno leśny, jak i ogrodowy może być alternatywnym źródłem antyutleniaczy w odniesieniu do popularnie stosowanych ziół. Ekstrakty z owoców borówek zawierają kwasy fenolowe: kwas p-hydroksybenzoesowy, galusowy, kawowy, chlorogenowy, p-kumarowy, ferulowy i protokatechowy oraz flawonoidy: kwercetynę, katechinę, epikatechinę i mirycetynę. Najuboższe w związki polifenolowe okazały się ekstrakty z owoców borówki wysokiej, które zawierają głównie kwas chlorogenowy. Największą różnorodnością pod względem zawartości jak i rodzaju związków polifenolowych charakteryzują się owoce borówki brusznicy, w których oznaczyłam najwięcej kwasu ferulowego, katechiny i epikatechiny w porównaniu do borówki czarnej i wysokiej. Antocyjany są dominującą grupą związków polifenolowych zawartych w jagodach, ich najbogatszym źródłem są owoce borówki czernicy zawierające 10-krotnie więcej tych związków niż ekstrakty z owoców borówki brusznicy i borówki wysokiej. Za silne właściwości antyutleniające borówki czernicy odpowiada duża zawartość antocyjanów w ich owocach, natomiast borówki brusznicy kwasy hydroksycynamonowe, w tym zwłaszcza kwas chlorogenowy. Najwyższe efektywności ekstrakcji polifenoli z jagód uzyskałam przy użyciu cieczy jonowych jako ekstrahentów.Owoce borówek leśnych zawierają takie makroelementy jak: potas, wapń i magnez oraz mikroelementy: mangan i cynk. Kory dębu i sosny są źródłem związków polifenolowych z grupy katechin, występujących zarówno w formie aglikonów jak i związanej w postaci glikozydów, estrów czy proantocyjanidynów. Katechina stanowiła ponad 50% całkowitej zawartości polifenoli oznaczonych w ekstrakcie z kory sosny. Ekstrakty z kory dębu zawierają dużą ilość kwasu p-hydroksybenzoesowego, katechiny, epikatechiny oraz kwasu protokatechowego i galusowego. Ponadto ekstrakty te charakteryzowały się wyższymi zdolnościami redukującymi w porównaniu do ekstraktów z kory sosny. Najwyższe wyniki uzyskałam dla ekstraktów przygotowanych przy użyciu octanu etylu oraz roztworu wodno-etanolowego (40/60, v/v). Porównując zawartość flawonoidów w badanych ekstraktach wyraźnie widać, że kory sosny i dębu są najbogatszym źródłem flawonoidów, niezależnie od tego z jakiego miejsca została pobrana próbka. Kora dębu zawiera bardzo dużo wapnia, potasu, magnezu oraz manganu. Stężenie potasu w korze sosny jest na podobnym poziomie jak w korze dębu, zaś zawartość pozostałych metali jest niższa. Przeprowadzone przeze mnie badania pokazały, że rośliny leśne ze względu na obecność znacznej ilości związków polifenolowych o właściwościach prozdrowotnych mogą być składnikiem zdrowej diety, a także mogą być wykorzystywane jako składniki farmaceutyków i nutraceutyków. Wyniki zawarte w rozprawie doktorskiej zostały opublikowane w 8 pracach oryginalnych oraz w formie rozdziałów w 1 zagranicznej i w 3 krajowych monografiach tematycznych.

The objective of the study was to determine the antioxidant activity as well as the content of some polyphenols of selected non-wood forests products. The parameters for extraction of these compounds such as kind of solvent, temperature and time were also evaluated. Non-wood forests products are the group of goods of biological origin other than wood derived from forests. Traditionally, they are used in folk medicine to treat some disorders and also as food additives. Heather flowers (Calluna vulgaris L.), bilberry (Vaccinium myrtillus L.), lingonberry (Vaccinium vitis-idaea L.), pine bark (Pinus silvestris L.) and oak bark (Quercus robur L.) were collected in central Poland (the Mazovia region). Ethyl acetate, water, ethanol and its mixture with water were used for the extraction. Furthermore the extraction efficiency of polyphenols from forest samples using ionic liquids based on imidazolium cation (1-butyl-3-methylimidazolium chloride, 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate and 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate) were evaluated and compared with organic solvents and water. Antioxidant capacity of the prepared extracts was screened by several spectrophotometric methods. The total reducing capacity was evaluated by Folin-Ciocalteu (FC) method (so-called total phenolic content) and cupric ion reducing antioxidant capacity (CUPRAC). The DPPH assay was applied to estimate the radical-scavenging ability of the extracts. The total content of anthocyanins was estimated according to pH differential method and the content of flavonoids was determined by method based on the complex formation with Al(III). The content of some polyphenols was determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS) and the concentrations of some elements were determined by inductively coupled plasma optical emission spectrometry. The extracts of non-wood forests products contain plenty of compounds with high antioxidant properties. Heather flowers are good source of chlorogenic, ferulic and p-hydroxybenzoic acid as well as catechin, epicatechin, quercetin, quercetrin and apigenin. The extracts of Calluna vulgaris may be considered as a rich source of chlorogenic acid (1 mg/g dried flowers). The presence of tricetin (5,7,3’,4’,5’-pentahydroxy flavone) was not reported yet. Bilberry extracts contain the highest amount of anthocyanins while lingonberries extracts contain plentiful of flavonoids and have the highest antioxidant capacity from all analyzed berries. Forest berries are good sources of K, Ca, Mg as well as Mn and Zn. Moreover, only low contents of toxic elements such as Pb and Cd were detected, ensuring the absence of risk for human health. Pine and oak bark accumulate a large amounts of polyphenolic compounds which exhibit a wide range of biological effects, including antioxidant activity. Bark extracts of Quercus robur L. contain a high amount of p-hydroxybenzoic, protocatechuic and gallic acid. Antioxidant activity of prepared extracts strongly depends on the nature of extracting solvent and extraction temperature due to the presence of different antioxidant compounds of varied chemical characteristics and polarities. Ethanol-water mixture was proved to be the best solvent. Room temperature ionic liquids which are novel and less toxic solvents than organic solvents can be used for extraction for a wide range of polyphenolic compounds. Several spectrophotometric methods should be applied for evaluation of antioxidant activity of non-wood forests products because there is no single, widely-acceptable assay method applicable to a reasonable variety of compounds in different matrices. Forest plants should be promoted as a dietary source of essential nutrients and health-beneficial compounds and may be applied as pharmaceutical and nutraceutical ingredients.