Nowe syntetyczne analogi kapu mRNA i ich zastosowania w badaniach biochemicznych i strukturalnych nad kompleksem enzymatycznym degradującym kap Dcp1/Dcp2 i innymi białkami oddziałującymi z kapem

Kap jest strukturą znajdującą się na 5’ końcu eukariotycznego mRNA mającą istotną rolę w metabolizmie komórki. Białka usuwające strukturę kapu takie jak kompleks Dcp1/2 mają natomiast znaczącą funkcję procesach degradacji mRNA. Jednak do tej pory ich mechanizm działania oraz sposoby regulacji aktywności nie zostały dokładnie poznane. Badania biochemiczne nad Dcp1/2 pokazały, że oddziałuje on specyficznie z m7GDP – produktem reakcji hydrolizy kapu. Zasugerowało to, że struktura m7GDP może być punktem wyjściowym dla syntezy nukleotydów mających większe powinowactwo do Dcp1/2, które mogą być wartościowymi narzędziami w badaniach biochemicznych. Przeprowadzono syntezy chemiczne oraz przebadano właściwości biologiczne serii analogów kapu opartych na strukturach nukleotydów takich jak m7GDP, m7GTP, oraz m7Gppppm7G. Związki te posiadają różnorodne modyfikacje w łańcuchu fosforanowym, takie jak grupa borano- lub tiofosforanowa, mające zwiększyć ich powinowactwo do białek wiążących kap. Otrzymano także szereg fluorescencyjnie znakowanych analogów kapu posiadające fluorofor o niewielkiej zawadzie sterycznej jako sondy molekularne w badaniach biofizycznych oraz narzędzia do syntezy fluorescencyjnego RNA. Po wykonaniu badań przesiewowych odkryto, że część z związków to inhibitory kompleksu Dcp1/2. Dalsze badania biochemiczne i strukturalne wykonano na najsilniejszym z inhibitorów (m7GpSpppSm7G izomer D3). Eksperymenty NMR pokazały położenie miejsca wiążącego inhibitor oraz powinowactwo tego związku do Dcp2. Badania kinetyczne pokazały, że badany inhibitor wiąże się zarówno z wolnym enzymem jak i kompleksem ES. Zaobserwowano też, że analogi kapu o wydłużonym łańcuchu fosforanowym są hydrolizowane przez Dcp2. Inne badania biochemiczne pokazały, że część z uzyskanych analogów kapu wykazuje silne powinowactwo do białka inicjującego translację eIF4E oraz posiadają obniżoną podatność na degradację enzymatyczną. Otrzymane fluorescencyjne analogi kapu są pierwszymi tego rodzaju związkami, które są inkorporowane do RNA in vitro. Niektóre z nich są także selektywnie odporne na działanie enzymów dekapujących Dcp1/2 bądź DcpS. Wstępne rezultaty badań biochemicznych świadczą, że znakowane fluorescencyjnie analogi kapu mogą być pomocne w badaniach oddziaływań kap-białko. W pracy opisano także przykładowe zastosowania modyfikowanych chemicznie analogów kapu w badania nad degradacją eukariotycznego mRNA. W ramach tych badań wykorzystano egzogenne mRNA zawierającego niehydrolizowany kap do śledzenia mechanizmów degradacji mRNA histonów w komórkach ssaczych. Dzięki temu poznano lepiej rolę Dcp1/2 w tym procesie oraz wpływie poliurydylacji 3’ końca mRNA na jego stabilność.

The cap is a structure located on 5’ terminus of eukaryotic mRNA and it has a substantial role in cellular homeostasis. Hence proteins involved in cap removal, such as Dcp1/2 complex play a vital function in mRNA degradation. Nevertheless their mechanisms of both action and regulation remains obscure. Biochemical studies on Dcp2 protein have shown that Dcp2 interacts specifically with m7GDP (a product of the cap cleavage). It suggested that m7GDP structure could be a starting point for preparation of nucleotides displaying higher affinity to Dcp2, which could become valuable tools for biochemical research. A number of cap analogues based on m7GDP, m7GTP or m7Gppppm7G structures was synthesised and their biological properties were examined. These compounds possess a variety of chemical modifications in their phosphate chain, including tio- or boranophosphate groups, which are expected to increase their affinity to cap-interacting proteins. Furthermore, a set of fluorescently labelled cap analogues was also prepared. Since their fluorophores are very compact these nucleotides should be useful for preparation of fluorescent mRNA or as molecular probes. A screening assay revealed that some of prepared nucleotides are inhibitors of Dcp1/2. Further biochemical and structural researches were conducted using the most potent inhibitor (m7GpSpppSm7G, isomer D3). NMR experiments allowed to unravel the nucleotide binding site and its affinity to Dcp2. Kinetic studies showed that the inhibitor is bind by both free enzyme and ES complex. It also have been observed that cap analogues with elongated phosphate chain are hydrolysed by Dcp2. Other biochemical studies showed that some of prepared cap analogues display high affinity to eIF4 translation factor and lower susceptibility to enzymatic degradation. Fluorescent cap analogues obtained in this study are the first such compounds which can be incorporated into RNA in vitro. Some of them are also selectively resistant to either Dcp2 or DcpS decapping enzymes. Preliminary biochemical experiments indicated that these fluorescent cap analogues could be applied to studies on cap-protein interactions. Exemplary applications of chemically modified cap analogues to study mRNA degradation was also desribed in this study. These experiments were based on usage of egzogenous mRNA, containing a non-hydrolysable cap analogue, to monitor the degradation of histone mRNA in mammalian cells. Obtained results provided a better understanding of the role of Dcp2 in these processes and the influence of 3’ mRNA uridylation on its stability.