Kompleksy platyny(II) z ligandami receptorów tachykininowych

Cisplatyna, nieorganiczny kompleks platyny należy od wielu lat do najskuteczniejszych leków przeciwnowotworowych. Choć niezwykle skuteczny niestety nie posiada wymaganej selektywności i działa cytotoksycznie zarówno na komórki nowotworowe, jak i na komórki zdrowe powodując szereg efektów ubocznych, takich jak: nefrotoksyczność (uszkodzenie funkcji nerek), ototoksyczność (zaburzenia słuchu), zaburzenia gospodarki elektrolitowej, neurotoksyczność (uszkodzenie komórek nerwowych), nudności i wymioty oraz uszkodzenie komórek szpiku kostnego. Dlatego też cały czas trwają badania nad opracowaniem związków, które charakteryzowałyby się większą selektywnością w stosunku do komórek nowotworowych. Jedną z możliwości jest dołączenie do fragmentu mającego działanie przeciwnowotworowe drugiego fragmentu, który w większym stopniu kierowałby całą cząsteczkę do komórek nowotworowych (np. liganda receptorów, które są obecne na powierzchni tych komórek w większym stężeniu). Tak zaprojektowany związek posiadałby właściwości antyproliferacyjne i miałby kierunkowe działanie na komórki nowotworowe. Przedstawiona praca doktorska prezentuje badania mające na celu zaproponowanie budowy oraz syntezy związków o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym przy jednoczesnym ukierunkowanym działaniu na komórki nowotworowe. Aby zaplanowane związki spełniały powyższe założenia musiały zawierać w swojej strukturze dwa fragmenty: fragment peptydowy będący ligandem receptorów tachykininowych występujących na błonach komórek nowotworowych w większym stężeniu w porównaniu do komórek zdrowych (farmakofor tachykininowy, wektor) i fragment kompleksujący jony platyny(II) (toksykofor). Dzięki takiej budowie możliwe jest uzyskanie działania przeciwnowotworowego przy jednoczesnym ukierunkowanym działaniu na komórki nowotworowe. Z przeprowadzonych do tej pory badań dotyczących wymagań strukturalnych ligandów receptorów tachykininowych wynika, że aby peptyd mógł wykazywać taką aktywność powinien posiadać na C-końcu ugrupowanie amidowe oraz przynajmniej dwa aminokwasy o aromatycznych grupach bocznych takich jak fenyloalanina, tryptofan czy histydyna. Aby cała cząsteczka peptydu zachowała powinowactwo do receptorów tachykininowych (ważny C-koniec peptydu) to fragment kompleksujący (toksykofor) jony platyny(II) musiał znajdować się na jego N-końcu. Jako fragment kompleksujący platynę wykorzystano aminokwasy posiadające atomy będące donorami elektronów do utworzenia wiązań koordynacyjnych z jonem platyny(II). Takie właściwości posiada histydyna, metionina, tyrozyna, seryna i kwas glutaminowy. Sekwencje aminokwasowe projektowanych ligandów peptydowych dobierano na podstawie opisanych w literaturze sekwencji antagonistów receptorów tachykininowych.. Część eksperymentalna projektu obejmująca syntezę kompleksów platyny(II) z ligandami receptorów tachykininowych została przeprowadzona w ramach dwóch głównych etapów syntetycznych. Pierwszy z nich obejmował syntezę peptydowych analogów receptorów tachykininowych na nośniku polimerowym z wykorzystaniem techniki SPPS (Solid Phase Peptide Synthesis). Następnie otrzymane peptydy poddawano reakcji kompleksowania z solą platyny(II) na dwa sposoby - po uprzednim odłączeniu peptydu od żywicy polimerowej bądź kompleksowanie peptydu na nośniku polimerowym. Z uwagi na fakt niskiej rozpuszczalności kompleksów platyny(II) z peptydami w wodzie zaplanowano wprowadzenie takiej modyfikacji struktur kompleksów aby polepszyć ich hydrofilowy charakter. W tym celu wykorzystano cząsteczki cukru - glukozy, które w wyniku reakcji Maillarda wprowadzano do struktury peptydu poprzez grupę -aminową lizyny. Otrzymywane związki kompleksowe analizowano metodami spektroskopowymi. Eksperymenty te obejmowały rejestrację widm magnetycznego rezonansu jądrowego oraz analizę z wykorzystaniem spektrometru mas. Analiza widm 195Pt NMR zmierzonych dla trzech peptydowych kompleksów platyny(II) potwierdziła monojądrowy charakter kompleksów platyny(II). Dodatkowo interpretacja zarejestrowanego dla jednego z kompleksów widma 2D 1H NMR pozwoliła na określenie miejsca wiązania atomu platyny do peptydu. Również analiza otrzymanych z eksperymentów spektrometrii mas widm fragmentacyjnych dostarczyła informacji o prawdopodobnych miejscach wiązania atomu platyny do peptydów. Innym etapem pracy eksperymentalnej była synteza radioliganda receptorów tachykininowych o sekwencji H-Lys-Phe(3H)-Phe(3H)-Gly-Leu-Met-NH2, który mógłby być wykorzystany do przeprowadzenia badań wiązania do receptorów otrzymywanych związków kompleksowych platyny zawierających wektor tachykininowy. Reakcję trytowania peptydowego prekursora zawierającego labilne atomy jodu ulegające substytucji na atomy trytu przeprowadzono w laboratorium peptydowym w Biological Research Center Węgierskiej Akademii Nauk w Szeged w grupie badawczej profesora Gezy Toth. Otrzymany znakowany ligand peptydowy został następnie dokładnie przebadany pod kątem powinowactwa do receptorów tachykininowych. Wyniki jakie otrzymano potwierdziły zakładaną aktywność i powinowactwo do receptorów tachykininowych, jednakże charakter wiązania okazał się na tyle mało specyficzny, że wykorzystanie tego związku do badań powinowactwa otrzymywanych peptydowych kompleksów platyny(II) do receptorów tachykininowych było niemożliwe. Spośród uzyskanych kompleksów platyny(II) z peptydami wybrano kilka związków o czystości pozwalającej na przeprowadzenie badań mających na celu weryfikację aktywności antyproliferacyjnej. Badania te przeprowadzono w Zakładzie Neuropeptydów IMDiK PAN, w grupie badawczej profesora Andrzeja Lipkowskiego. Pierwsze próby przeprowadzono z użyciem kompleksów platyny(II) słabo rozpuszczalnych w wodzie a jako medium użyto mieszaniny woda/DMF co uniemożliwiło uzyskanie odpowiednio wysokich stężeń badanych związków. Wyniki badań komórkowych z użyciem rozcieńczonych roztworów wskazały, że badane związki nie wykazują aktywności antyproliferacyjnej wobec komórek linii SEGA (komórki nowotworowe gwiaździaka podwyściółkowego olbrzymiokomórkowego). Dalsze badania komórkowe przeprowadzono po otrzymaniu kompleksów platyny(II) o zdecydowanie lepszej rozpuszczalności w wodzie z tym, że do badań wykorzystano linię komórkową komórek glejaka T986. Niestety i w tym przypadku zaobserwowano tylko nieznaczne zmniejszenie liczby komórek nowotworowych w obecności badanych związków czego przyczyną może być zbyt silne wiązanie platyny(II) do struktury peptydu uniemożliwiające hydrolizę cytotoksycznego fragmentu a tym samym jego destrukcyjne działanie na komórkowe DNA. Pomimo tego, iż dla otrzymanych związków nie udało się wykazać działania przeciwnowotworowego, co było głównie spowodowane bardzo słabą rozpuszczalnością otrzymanych peptydowych kompleksów platyny(II) to mam nadzieję, że przedstawione w ramach zrealizowanej pracy doktorskiej wyniki badań powiększyły zasób wiedzy o możliwości wykorzystania neuropeptydów do tworzenia kompleksów platyny(II) pod kątem badań nad zwalczaniem chorób nowotworowych.

The inorganic drug cisplatin is highly efficient in the treatment of a number of solid malignancies through triggering apoptotic pathways in the tumor cells. The application of cisplatin is, however, hampered by systemic toxicity, with dose-limiting side-effects including neuro- and nephrotoxicity. An important strategy towards reducing systemic toxicity is to improve delivery of the platinum drugs to their target. We have previously proposed to use ligands for specific receptors, which are present on the cancer cell membranes in higher concentration, comparing to the normal tissue, as prospective selective carriers of platinum(II) ion. Here in my PhD dissertation as targeting motif we have proposed to use tachykinin peptide analogs, because tachykinin receptors were found on many types of cancer cell’s membranes. The idea of platinum moiety selective delivery was based on bifunctional structure design consisting of peptide ligand (pharmacophore, address) and anticancer drug functionalities (toxicophore, fragment coordinating Pt(II) ion). Proposed hybrid molecules combine tachykinin pharmacophore fragment linked with terminal platinum complex (Fig 1). Fig. 1. Model structure of platinum-tethered peptide complexes (where [X,Y]=N,O,S) As carrier ligands, responsible for platinum drug delivery, tachykinin receptor antagonists were chosen. As the fragments capable of Pt(II) ion coordination natural amino acids were selected such as histidine, methionine, thyrosine, serine and glutamic acid. A number of platinum(II)-peptide complexes have been synthesized using two methods. Both of them assume solid phase synthesis of peptide ligand using Rink-amide polystyrene resin. The difference appeared in the metal complexation - it was carried on both on solid phase or in water-methanol solution, after cleaving the peptide from resin. Also a modification that lead to enhanced water solubility was applied to some structures as it was necessary for further biological studies. Obtained complexes have been characterised by various spectroscopic methods such as mass spectrometry, MS fragmentation experiments, 195Pt NMR spectroscopy, 2D NMR experiments. In order to get information about selective binding to tachykinin receptors a radiolabeled compound - ligand to tachykinin receptors has been synthesized. It was supposed to be used for further studying of receptor binding affinities of obtained platinum(II) complexes with tachykinin receptor ligands. Unfortunately pharmacokinetic study of radiolabeled ligand showed no specific binding affinity and could not be used for further experiments. In addition few complexes have been tested in in vitro experiments against two cancer cell lines: SEGA (subependymal giant cell astrocytoma) and T-98G human glioma.