Application of homology modeling to study the function of proteins and their interactions with ligands

Modelowanie homologiczne jest uważane za najdokładniejszą z metod obliczeniowych służących do przewidywania struktury trzeciorzędowej białek. W swoich badaniach zastosowałem modelowanie homologiczne do badania funkcji białek oraz ich oddziaływań z ligandami. Skupiłem się na dwóch typach białek: eukariotycznych czynnikach inicjujących translację 4E (eIF4Es) oraz niekanonicznych poli(A) polimerazach (PAPs). Badania biochemiczne oraz szczegółowa analiza modeli homologów eIF4E przyczyniły się do lepszego zrozumienia różnić w oddziaływaniach pomiędzy czapeczką RNA a izoformami eIF4E z Arabidopsis oraz Drosophila. Porównanie modelu 3D białka CutA z wyznaczonymi eksperymentalnie strukturami białek poli(U) polimerazy (PUP) Cid1 oraz niekanonicznej poli(A) polimerazy Trf4, wraz z analizą wyników ukierunkowanej mutagenezy, pozwoliły na zdefiniowanie i opisanie miejsca wiązania nukleotydu, w którym unikatowy motyw obecny w niekanonicznych PAPs oraz PUPs, odgrywa kluczową rolę w obserwowanej preferencji substratowej CutA względem cytydyny. Dodatkowo, kompleksowa analiza różnych informacji biologicznych dostępnych w literaturze i bazach danych, połączona z analizą sekwencji i struktury przy wykorzystaniu najnowocześniejszych metod służących do wykrywania dalekich homologów, rozpoznawania foldu oraz modelowania struktur 3D białek, pozwoliła na sklasyfikowanie niescharakteryzowanych białek należących do rodziny FAM46 jako cytoplazmatycznych i/lub jądrowych niekanonicznych poli(A) polimeraz. Przedstawione badania pokazują, że modelowanie homologiczne może być skutecznie wykorzystane do wyjaśnienia danych biochemicznych dotyczących specyficzności substratowej, planowania nowych eksperymentów biochemicznych w celu zmiany specyficzności enzymatycznej oraz przypisania funkcji biologicznej badanym białkom.

Homology modeling is considered to be the most accurate of the computational structure prediction methods. In my studies I used homology modeling to investigate the function of proteins and their interactions with ligands. I focused on two types of proteins: eukaryotic translation initiation factors 4E (eIF4Es) and non-canonical poly(A) polymerases (PAPs). Biochemical binding studies and detailed analysis of homology models gave better insight into the molecular characteristic of varying cap-binding abilities of Arabidopsis and Drosophila eIF4E isoforms. Comparison of the 3D model of fungal CutA with solved crystal structures of poly(U) polymerase (PUP) Cid1 and non-canonical poly(A) polymerase Trf4, together with site-directed mutagenesis, allowed to define an unusual nucleotide-binding site, in which the unique nucleotide recognition motif present in the non-canonical PAPs and PUPs is mainly responsible for the observed preference of CutA toward cytidine. Finally, comprehensive analysis of various biological information available in literature and databases combined with numerous sequence and structure analyses, including a state-of-the-art distant homology detection, fold recognition and 3D modeling, allowed to classify uncharacterized FAM46 family members to cytoplasmic and/or nuclear non-canonical poly(A) polymerases. Presented studies show that homology modeling might be successfully used in explaining biochemical data related to substrate binding and specificity, planning new biochemical experiments to change the enzyme specificity and annotating protein function.