Biomimetyczne filmy lipidowe i ich oddziaływania z lipopeptydami o właściwościach antybakteryjnych

Praca doktorska dotyczy biomimetycznych filmów lipidowych oraz ich oddziaływań z antybakteryjnymi lipopeptydami. Wzrastająca oporność bakterii wobec obecnie stosowanych antybiotyków prowadzi do poszukiwania nowych związków, które podejmą wyzwanie w walce z tymi drobnoustrojami. Lipopeptydy mogą okazać się obiecującą klasą grupą antybiotyków antybakteryjnych. W tej pracy ocenie zostali poddani przedstawiciele dwóch grup tych związków: daptomycyna i syntetyczne lipopeptydy będące liniowymi pochodnymi batacyny. Szereg metod wykorzystujących filmy molekularne, zarówno na granicy faz powietrze-woda, jak i na stałym podłożu, posłużyło do zbadania oddziaływań wyżej wymienionych lipopeptydów z membranami lipidowymi charakterystycznymi dla bakterii gram-dodatnich lub gram-ujemnych. Pracę doktorską rozpoczyna wprowadzenie dotyczące celu przeprowadzonych badań. Praca została podzielona na części: literaturową i eksperymentalną. Część literaturową rozpoczyna rozdział o błonie komórkowej, w którym zostały scharakteryzowane królestwa Procaryota i Eucaryota oraz główne składniki błony komórkowej i bakterie. Kolejny rozdział dotyczy charakterystyki lipopeptydów: rozpoczyna go wprowadzenie na temat jednego z największych problemów zdrowia publicznego – oporności na antybiotyki; następnie, omówione zostały lipopeptydy wraz ze szczegółowym opisem daptomycyny oraz batacyny. Później skupiono się na badaniach antybiotyków pod względem biologicznym i zostały scharakteryzowane dwie popularne metody stosowane w laboratoriach: wyznaczanie minimalnego stężenia hamującego oraz pomiar wzrostu bakterii. Następnie, została opisana metodyka pomiarów. Część literaturową kończy opis metod przenoszenia monowarstw i osadzania dwuwarstw na podłożach stałych. Część eksperymentalną rozpoczyna opis odczynników, aparatury i przygotowania eksperymentów. Rozdział ten zawiera również krótki opis syntezy i danych charakterystycznych zsyntezowanych liniowych pochodnych batacyny. Następnie, zostały przedstawione badania dotyczące charakterystyki biomimetycznej membrany lipidowej zbudowanej z fosfatydyloetanoloamin i fosfatydylogliceroli z bakterii E. coli: rozdział ten zawiera szczegóły układu PE:PG (8:2) przeniesionego na granicę faz powietrze-woda oraz na stałe podłoże (mika lub złoto). Wyniki wskazują, że na organizację cząsteczek w dwuwarstwie oraz jej właściwości nanomechaniczne ma wpływ charakter wybranego podłoża oraz mechanizmu tworzenia się membrany. Kolejny rozdział przedstawia charakterystykę modelowej błony lipidowej o składzie reprezentatywnym tym razem dla bakterii S. aureus. Zostały przedstawione wyniki uzyskane dla monowarstwy POPG:DPPG:CL (1:1:2) na granicy faz powietrze-woda oraz dwuwarstwy lipidowej osadzonej na elektrodzie złotej wstępnie zmodyfikowanej tioglukozą. Obecność tioglukozy umożliwia oddzielenie dwuwarstwy od powierzchni metalicznej, a także poprawę hydratacji lipidowych głów polarnych w dolnej części dwuwarstwy. Rozdział ten zawiera także wyniki eksperymentów mających na celu zrozumienie oddziaływanie daptomycyny z błoną lipidową POPG:DPPG:CL (1:1:2). Wykazano, że daptomycyna wpływa na przepuszczalność błony, jednak jej działanie może być bardziej złożone niż ogólnie przyjęty prosty model tworzenia porów. W przedostatnim rozdziale zostały poddane badaniom zsyntezowane lipopeptydy będące pochodnymi batacyny względem różnych rodzajów bakterii. Każdy z lipopeptydów posiadał lipofilowy zbudowany z kwasu 4-metyloheksanowego. Różnice pomiędzy lipopeptydami (C7-xXXLfX, C7-xXLfX, C7-xLfX) wynikały z różnych ilości reszt kwasu L-2,4-diaminomasłowego w łańcuchu peptydowym. Lipopeptydy zostały przebadane przy pomocy metody Langmuira (izotermy Π-A, badanie stabilności) na granicy faz powietrze-woda i wykorzystano trzy biomimetyczne filmy lipidowe reprezentujące błony: E. coli, P. aeruginosa i S. aureus. Część eksperymentalną kończy podsumowanie otrzymanych wyników. Ostatni rozdział to spis literatury.

Doctoral dissertation concerns the biomimetic lipid films and their interactions with antimicrobial lipopeptides. Due to the increasing resistance of bacteria against currently used antibiotics, new compounds are being sought that will be able to take up the challenge and fight with these pathogens. Lipopeptides can be considered as a promising class of antimicrobial antibiotics. In this work the representatives of two groups of these compounds were evaluated: daptomycin and synthetic lipopeptides that are linear derivatives of battacin. A number of methods utilizing molecular films, both at the air-water interface and on a solid substrate, were used to investigate the interactions of the above-mentioned lipopeptides with lipid membranes characteristic either for gram-positive or gram-negative bacteria. Doctoral dissertation begins with a introduction presenting the aim of the study. This work is divided into parts: literature and experimental. The literature section begins with the chapter describing the cell membrane, where the Procaryota and Eucaryota and the main components of the cell membrane and bacteria have been characterized. The next chapter provides characterization of the lipopeptides: it begins with an introduction to one of the biggest problem of public health – antibiotic resistance; then the lipopeptides are discussed along with a detailed description of daptomycin and battacin. Then, the focus is on the biological studies of antibiotics and two popular methods used in the laboratories have been characterized: determination of minimal inhibitory concentration and the measurement of bacterial growth. Next, the methodology has been described. The literature part ends with the description the methods monolayer and bilayer deposition onto the solid substrates. The experimental part begins with a description of the reagents, equipment and preparation of the experiments. This chapter contains also a short description of the synthesis and characteristics of the synthesized linear battacin derivatives. Next, the biomimetic lipid membrane composed of phospatidylethanolamines and phosphatidylglycerols from E. coli has been presented: it contains the details concerning PE:PG (8:2) system which was investigated at the air-water interface as well as on a solid substrate (mica or gold). The results show that the organization of molecules in the bilayer and its nanomechanical properties depend on the nature of solid substrate and the mechanism of membrane formation. The next chapter presents the characteristics of model lipid membrane representative for S. aureus. The results obtained for the POPG:DPPG:CL (1:1:2) monolayer at the air-water interface and the bilayer deposited on the gold electrode pre-modified with thioglucose monolayer were presented. The presence of thioglucose enables separation of the bilayer from the metal surface and improvement of the hydration of lipid polar heads in the lower part of the bilayer. This chapter contains also the results from the experiments aimed at understanding the interaction of daptomycin with POPG:DPPG:CL (1:1:2) lipid membrane. It is demonstrated that daptomycin affects membrane permeability, but its mode of action could be more complex than broadly accepted simple pore-forming model. In the penultimate chapter, the synthesized linear battacin derivatives have been examined against various types of bacteria. Each of lipopeptides had a lipophilic chain composed of 4-methylhexanoic acid. Differences between lipopeptides (C7-xXXLfX, C7-xXLfX, C7-xLfX) were based on different number of L-2,4-aminobutyric acid residues in the peptide chain. Lipopeptides were examined using the Langmuir technique (Π-A isotherm, stability tests) at the air-water interface and three biomimetic lipid films with composition mimicking the membranes of E. coli, P. aeruginosa and S. aureus were utilized. The experimental part ends with a summary of the results. The last chapter is the list of the references.