Licencja
Udział peroksydacji lipidów w odpowiedzi komórki na uszkodzenia DNA a niedokrwistość Fanconiego
Abstrakt (PL)
STRESZCZENIE Niedokrwistość Fanconiego (FA) to rzadka choroba genetyczna, dziedziczona w sposób autosomalnie recesywny lub sprzężony z chromosomem X. Pacjenci z FA posiadają liczne zaburzenia rozwojowe (hematopoeza) i deformacje (układ kostny) oraz częściej, niż ludzie zdrowi zapadają na nowotwory (białaczki). Komórki pacjentów z zespołem FA są nadwrażliwe na czynniki sieciujące DNA (np. mitomycynę C, czy cis-platynę) i charakteryzuje je wysoka niestabilność genomowa oraz bardzo często status prooksydacyjny. Fenotyp chorobowy związany jest z mutacjami w obrębie genów kodujących 16 białek, które wchodzą w skład szlaku Fanconiego. Szlak FA uruchamiany zostaje podczas stresu replikacyjnego, a białka wchodzące w jego skład koordynują naprawę międzyniciowych wiązań krzyżowych DNA (ICL) i stabilizują widełki replikacyjne, zapewniając integralność genomową. Pomimo bogatej wiedzy na temat choroby, etiologia zespołu FA nie jest jeszcze do końca poznana. Do dziś, nie udało się zidentyfikować m. in. endogennych substratów dla białek szlaku Fanconiego. Status prooksydacyjny komórek FA-/- sprzyja wzrostowi poziomu wolnych rodników tlenowych (ROS), co może prowadzić do uruchomienia procesu peroksydacji lipidów (LPO) i powstania reaktywnych aldehydów, wśród których znajduje się 4-hydroksynonenal (HNE). Wolne rodniki tlenowe oraz produkty LPO modyfikują składniki komórki, w tym zasady DNA, wprowadzając uszkodzenia oksydacyjne i alkilacyjne. HNE jest cząsteczką sygnałową regulującą wiele procesów biologicznych komórki poprzez interakcje z biomolekułami, tworząc addukty do białek i DNA, a wśród nich najbardziej toksyczne dla komórki, ICL. Liczne spekulacje środowiska naukowego i zebrana dotychczas wiedza pozwalają przypuszczać, że produkty LPO (w tym HNE) są dobrymi kandydatami na indukcję endogennych substratów białek ścieżki Fanconiego. Niniejsza praca ma aspekt dwuwymiarowy. Po pierwsze, jest próbą wyjaśnienia w jaki sposób stres oksydacyjny, a szczególnie związana z nim peroksydacja lipidów i powstające endogennie uszkodzenia DNA przyczyniają się do wystąpienia objawów i postępu niedokrwistości Fanconiego. Po wtóre, jest studium nad wpływem peroksydacji lipidów na podstawowe procesy biologiczne, a w szczególności na (i) kształtowanie się odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) oraz na (ii) mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA. Podczas prowadzonych badań wykazano, że zarówno ludzkie komórki HeLa, jak i kurze DT40 WT są wrażliwe na 4-hydroksynonenal, przy czym mutanty DT40 poszczególnych kompleksów szlaku FA są nadwrażliwe na HNE w stosunku do linii typu podstawowego. Być może obserwowane zjawisko związane jest z indukcją endogennych uszkodzeń DNA przez produkty LPO. W niniejszej pracy pokazano, że w obecności HNE, w komórce dochodzi do powstania pojedynczoniciowych i podwójnoniciowych (SSB i DSB) pęknięć DNA, niewielkiej liczby międzyniciowych wiązań krzyżowych (ICL) oraz indukcji oksydacyjnych uszkodzeń DNA. Wykazano również, że obecność endogennych uszkodzeń DNA, indukowanych przez HNE prowadzi do stresu replikacyjnego i spowolnienia postępu widełek replikacyjnych, silniejszego w badanych mutantach DT40 FA-/-, niż w komórkach WT. Następnie przebadano aktywację szlaku Fanconiego i systemu odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) indukowane wyłącznie przez 4-hydroksynonenal oraz inne związki (kamptotecynę CPT i hydroksymocznik HU) w obecności HNE. W przeciwieństwie do hydroksymocznika i kamptotecyny, komórka w odpowiedzi na HNE nie aktywuje szlaku Fanconiego (brak monoubikwitynacji białka FANCD2). Pokazano również, że po traktowaniu komórek HNE dochodzi do hamowania monoubikwitynacji FANCD2 indukowanej w czasie stresu replikacyjnego, wywołanego działaniem kamptotecyny i hydroksymocznika. Aktywacja szlaku Fanconiego zależy od prawidłowej sygnalizacji (fosforylacja) w obrębie systemu odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR). W skutek działania kamptotecyny i hydroksymocznika dochodziło do prawidłowej aktywacji systemu DDR, tj. w przypadku CPT uruchomienie dwóch wewnętrznych ścieżek, związanych z odpowiedzią na obecność pęknięć DNA (ATM-CHK2-H2AX-RPA) oraz odpowiedzią na stres replikacyjny (ATR-CHK1-FANCD2), a w przypadku HU włączenia samej odpowiedzi na stres replikacyjny. Po potraktowaniu komórek HNE zaobserwowano na początku blokadę systemu DDR, a po 6h inkubacji uruchomienie wyłącznie ścieżki związanej z odpowiedzią na pęknięcia DNA (ATM-CHK2-H2AX-RPA). Odpowiedź DDR indukowana przez kamptotecynę i hydroksymocznik, ulega również w obecności HNE hamowaniu, co pokazuje spadek poziomu fosforylacji białek, składowych ścieżek ATM-CHK2-H2AX-RPA i ATR-CHK1. Pokazano również, że w obecności HNE spada poziom fosforylacji, innych niż białka CHK, substratów nadrzędnych kinaz DDR (ATM/ATR), KAP1 i SMC1, aktywowanych przez CPT, natomiast podczas działania samego HNE w ogóle nie dochodzi do ich fosforylacji. Przeprowadzone badania wykazały również, że odzyskanie pełnej funkcjonalnej aktywności DDR, blokowanej przez HNE trwa 24h. Po 6h od traktowania komórek HNE zaobserwowano także (i) akumulację komórek w fazie G2 cyklu komórkowego i (ii) aktywację kinazy DNA PKcs, co może świadczyć o uruchomieniu naprawy pęknięć DNA na drodze rekombinacji niehomologicznej (NHEJ). Pokazano również, że głównie po 2h od traktowania komórek HNE wzrasta ekspresja polimeraz systemu TLS (w komórkach WT ζ, w komórkach FANCM -/- κ, θ, ζ) oraz genów systemu ALKB (głównie ALKB2), które mogą naprawiać lub niwelować szkodliwe skutki obecności adduktów HNE do DNA w komórce. Działanie HNE skutkuje zaburzeniem odpowiedzi DDR prowadząc m. in do braku aktywacji ścieżki FA i mechanizmu rekombinaji homologicznej (HR), czyli nieefektywnej koreplikacyjnej naprawy uszkodzeń DNA i promowania szybkiej i niedokładnej naprawy (NHEJ, TLS). Podczas realizacji badań wykazano również, że HNE rozregulowuje proces transkrypcji, wpływając zarówno na poziom, jak i aktywność białka EGFP systemu reporterowego. Obecność HNE indukuje również apoptozę, a w przypadku wstępnej inkubacji i dalszego działania innych związków toksycznych dla komórki nasila proces programowanej śmierci. Reasumując, rola peroksydacji lipidów w etiologii zespołu Fanconiego wydaje się być istotna. HNE indukuje stres oksydacyjny i wprowadza uszkodzenia do DNA. Jednocześnie oddziałując z białkami zaburza procesy fizjologiczne komórki, w tym (i) moduluje aktywność systemu detekcji uszkodzeń (DDR) ograniczając możliwości dokładnej naprawy uszkodzeń DNA i (ii) moduluje status redoks komórki. Niedokładna naprawa uszkodzeń DNA indukowanych oraz pochodzenia endogennego może przyczynić się do postępu zespołu Niedokrwistości Fanconiego poprzez (i) nasilenie procesu apoptozy, prowadzącego do zaburzeń rozwojowych lub (ii) pojawienie się mutacji sprzyjających indukcji nowotworowej.
Abstrakt (EN)
ABSTRACT Fanconi Anemia (FA) is a rare genetic disease inherited in an autosomal recessive manner, or linked to the X chromosome. Patients with FA have numerous developmental disorders (hematopoesis) and deformations (the skeleton), and are predisposed to cancer, particularly leukemias. The cells of FA patients are hypersensitive to crosslinking agents (e.g. mitomycine C or cis-platinium), and are characterized by high genomic instability as well as prooxidative status. FA phenotype is linked to mutations in genes coding for 16 proteins that create a Fanconi pathway. FA pathway is activated by replicative stress, and proteins which constitute the system are engaged in coordination of interstrand DNA crosslinks (ICL), and stabilize replicative forks, thus ensuring genomic stability. In spite of a quite large knowledge about the disease, the ethiology of FA syndrome is not well known. For example, endogenous substrates for FA proteins were not identified. Prooxidative status of FA-/- cells favours increase of the level of reactive oxygen species (ROS), which may which may lead to lipid peroxidation (LPO) and formation of reactive aldehydes, like 4-hydroxynonenal (HNE). ROS as well as LPO products modify cellular components, including DNA bases, in this way introducing oxidative and alkyl DNA lesions. HNE is a signalling molecule, which regulates several biological processes by interacting with and forming adducts to proteins and DNA bases, among which the most toxic to the cell are ICLs. Recently, it was speculated that LPO products (including HNE) are probable to induce endogenous substrates for the Fanconi pathway. This work is twodimentional. First, it attempts to explain how oxidative stress, and particularly endogenous DNA lesions formed during lipid peroxidation contribute to syndromes and progression of Fanconi Anemia. Second, this dissertation studies the effect of lipid peroxidation on the basic biological processes, particularly such as (i) activation of DNA damage response (DDR), and (ii) the mechanisms of DNA repair. This work shows that both human HeLa and chicken DT40 cells are sensitive to HNE, and DT40 mutants in three different complexes of FA pathway are more sensitive to HNE than the wild type cells. This may be caused by an inability of FA mutants to repair endogenous damage induced by LPO products. Here was also shown that HNE induces in cells single-, and double strand breaks (SSB and DSB), as well as a small quantity of interstrand crosslinks (ICL) and oxidative DNA damage. The presence of DNA lesions induced by HNE leads to replicative stress and slowing down of progression of replicative forks, which was stronger in DT40 FA-/- mutants than in wild type cells. Subsequently, FA pathway DNA damage response (DDR) activation by 4-hydroxynonenal itself and in combination with other genotoxins (camptotecin, CPT and hydroxyurea, HU). In contrast to hydroxyurea and camptothecin, in response to HNE the cell does not activate FA pathway (lack of FANCD2 monoubiquitination). It was also shown that pretreatment of cells with HNE inhibits FANCD2 monoubiquitination, which occurs during replicative stress induced by CPT or HU. FA pathway activation depends on the proper signalization (phosphorylation) within DNA damage response system (DDR). Camptothecin and hydroxyurea alone activated properly DDR. CPT activated both internal pathways, related to DNA strand breaks (ATM-CHK2-H2AX-RPA), and replicative stress pathway (ATR-CHK1-FANCD2). Hydroxyurea activated only replicative stress pathway. Treatment of cells with HNE resulted first in the blockage of the DDR system, and 6 h after treatment activation of only DDR pathway related to DNA breaks (ATM-CHK2-H2AX-RPA). DDR response induced by CPT and HU was also inhibited by HNE, which was visualized by the decrease of the level of phosphorylated proteins within ATM-CHK2-H2AX-RPA and ATR-CHK1-FANCD2 DDR pathways. It was also shown that in the presence of HNE camptothecin indcuces lower amount of phosphorylated substrates of ATR/ATM, other than CHK, such as KAP1 and SMC1. In the presence of HNE alone KAP1 and SMC1 are not phosphorylated at all. It was also shown here that a cell needs 24 h for re-gaining of DDR function after HNE treatment. It was also observed that 6 h after HNE treatment (i) cells are accumulating in G2 phase of the cells cycle; (ii) DNA-PKcs is activated, which may indicate activation double-strand break repair by non-homologous end-joining (NHEJ). It was also shown that 2 h after HNE treatment mRNA level of TLS DNA polymerases increases (in wild type cells Pol , in FANCM-/- pol , , ), as well as ALKB2 gene, which may reduce adverse effects of the presence of DNA lesions induced by HNE. HNE action on the cell results in disordered DNA damage response, which leads to the lack of activation of the FA pathway and homologous recombination and promotion of quick, low fidelity NHEJ and TLS pathways. It was also demonstrated that HNE deregulates transcription, and affects the level as well as the activity of reporter EGFP protein. The presence of HNE also induces apoptosis, which is significantly augmented in the presence of other genotoxic compounds. Summing up, the role of lipid peroxidation in the ethiology of Fanconi Anemia seems to be important. HNE induces oxidative stress and introduces DNA lesions. Simultaneously, by interacting with proteins it affects cellular physiological processes, including: (i) modulation of DNA damage response (DDR), which limits the possibility of accurate DNA repair, and (ii) modulation of the cellular redox status. Low fidelity repair of endogenous DNA lesions may result in either accelerated apoptosis and developmental disorders or mutations and induction of cancer, which are both observed in Fanconi Anemia.