Lactic acid bacteria as carriers of Campylobacter antigens for immunoprophylaxis

Obiektem badań prezentowanej rozprawy doktorskiej była Gram-ujemna pałeczka Campylobacter jejuni. Główną przyczyną ludzkich przypadków kampylobakteriozy jest spożycie mięsa drobiowego zanieczyszczonego komórkami tego patogenu. Badania przeprowadzone w ramach niniejszej rozprawy są częścią projektu mającego na celu skonstruowanie przeznaczonej dla drobiu, podjednostkowej szczepionki, która obniżałaby poziom kolonizacji jelit ptaków przez patogenne dla ludzi mikroorganizmy rodzaju Campylobacter.Atrakcyjnymi kandydatami do konstrukcji wektorów szczepionkowych są bakterie kwasu mlekowego (LAB). Celem pierwszych eksperymentów było skonstruowanie szczepów LAB prezentujących na powierzchni antygeny bądź epitopy antygenów Campylobacter. Do projektu zostały wybrane dwa silnie immunogenne białka: CjaD oraz CjaA. Fuzja translacyjna tych białek z domeną kotwiczącą autolizyny AcmA Lactococcus lactis umożliwiła ich niekowalencyjne związanie z peptydoglikanem osłon szczepów LAB. Dodatkowo analizowano wiązanie rekombinowanych białek do cząstek GEM (Gram-positive Enhancer Matrix) powstałych w wyniku gotowania komórek LAB w kwasie trójchlorooctowym (TCA). Białka fuzyjne wiążą się do cząstek GEM ze znacznie większą wydajnością niż do komórek żywych. Zaobserwowano także, że rekombinowane białka przyłączają się jedynie na biegunach komórek żywych, podczas gdy w przypadku komórek traktowanych TCA do całej ich powierzchni. Udowodniono więc, że odpowiednia modyfikacja białek umożliwia ich prezentację na powierzchni cząstek GEM, a jednocześnie cząstki GEM mogą być wykorzystane jako platforma do prezentacji różnych, co najmniej dwóch, antygenów Campylobacter.Kolejnym etapem badań była konstrukcja hybrydowego białka zawierającego epitopy kilku antygenów. Modelowanie strukturalne CjaA pozwoliło wyznaczyć miejsca, w które można wstawić dodatkowe epitopy bez naruszania struktury białka nośnikowego i jednocześnie zapewnić powierzchniową lokalizację epitopów drugiego immunogennego białka - CjaD. Rekombinowane białko CjaA z epitopami białka CjaD (rCjaAD) jest rozpoznawane zarówno przez surowicę anty-CjaA jak i anty-CjaD, a co ważniejsze surowica anty-rCjaAD rozpoznaje natywne antygeny CjaA i CjaD obecne w lizacie C. jejuni. Świadczy to o immunogenności otrzymanego rekombinowanego białka. Fuzja translacyjna rCjaAD z domeną LysM umożliwiła jego prezentację na powierzchni cząstek GEM.Potencjał otrzymanych prototypów szczepionek analizowano w eksperymentach protekcyjnych na modelu kurzym. Kurczęta immunizowano podskórnie lub per os. Szczepionka składająca się z cząstek GEM L. salivarius prezentujących na powierzchni CjaA i CjaD nie wywołała efektu ochronnego. Natomiast cząstki GEM L. salivarius prezentujące rCjaAD podane in ovo do zarodka kury w niewielkim stopniu obniżyły poziom kolonizacji jelita ptaków przez pałeczki Campylobacter w porównaniu do grupy kontrolnej.Oprócz drogi podania, istotnym czynnikiem wpływającym na skuteczność immunizacji jest wybór szczepu nośnikowego. W tym charakterze postanowiono wykorzystać szczepy rodzaju Lactobacillus wyizolowane od kurcząt. Badania objęły ponad sto szczepów. Działanie antagonistyczne wobec Campylobacter korelowało ze stężeniem mleczanów obecnych w supernatancie znad hodowli badanych szczepów. Wybrane szczepy następnie przebadano pod kątem właściwości probiotycznych. Ostatecznie, do badań in vivo na modelu zwierzęcym, wybrano pięć szczepów. Obniżenie poziomu kolonizacji jelit ślepych kurcząt przez pałeczki Campylobacter zaobserwowano po podaniu ptakom szczepu L. plantarum. Tak więc uznano, że mogą być one obiecującymi nośnikami antygenów Campylobacter.Przeprowadzone eksperymenty poszerzają naszą wiedzę na temat immunogennych białek Campylobacter, lokalizacji ich epitopów oraz konstrukcji hybrydowych białek. Dodatkowo dostarczają informacji na temat bakterii kwasu mlekowego jako nośników heterologicznych białek. Uzyskane wyniki mogą być użyteczne przy opracowaniu szczepionek przeciwko innym patogenom drobiu

The subject of the presented dissertation was a Gram-negative bacteria, Campylobacter jejuni. The consumption of poultry meat contaminated with Campylobacter cells is the main source of human campylobacteriosis. The presented work is a part of the project with the main goal of construction the effective subunit vaccine for poultry in order to decrease the colonization level of the bird’s intestine, by Campylobacter species.Lactic acid bacteria (LAB) are attractive candidates for vaccine mucosal delivery vehicles. Initial experiments evaluated whether LAB can be used as a surface platform for Campylobacter antigens. We showed that recombinant proteins that contain C. jejuni antigens (CjaA or CjaD) fused with the protein anchor (PA) of the L. lactis peptidoglycan hydrolase AcmA, which comprises 3 LysM motifs noncovalently bind to peptidoglycan of non-treated and TCA treated cells (GEM particles - Gram-Positive Enhancer Matrix). Immunofluorescence microscopy demonstrated an increased binding efficiency of fusion proteins to GEM particles compared to live cells. It has been observed that recombinant proteins attach only to the poles of live cells, whereas in the case of TCA-treated cells they bind to their entire surface. So, it was demonstrated that appropriate modification of antigens allows their cell surface display and GEM particles can serve as a platform for the presentation of at least two Campylobacter antigens.The next step of my work covered a construction of a hybrid protein consisting of epitopes of heterologous antigens. The structure based approach combine with the identification of the CjaA and CjaD epitopes allowed to construct CjaA antigen that presents CjaD epitopes on its surface. It has been shown that the hybrid protein (rCjaAD) is recognized by both anti-CjaA and anti-CjaD sera. More importantly the rabbit anti-rCjaAD serum recognizes the native CjaA and CjaD antigens present in the C. jejuni lysate, demonstrating the immunogenicity of the resulting recombinant protein. The rCjaAD translational fusion with the LysM domain assured its presentation on the surface of GEM particles.The potential of constructed vaccine prototypes were analyzed by challenge experiments in the hen's model. Chickens were immunized subcutaneously and orally. The vaccine consisting of L. salivarius GEM particles presenting on the surface CjaA and CjaD did not produce any protective effect. On the other hand, GEM L. salivarius particles presenting rCjaAD administered in ovo to the chicken embryos slightly lowered the level of intestine colonization by Campylobacter in comparison to the control group.In addition to the route of administration also the choice of the carrier strain constitutes a significant factor influencing the effectiveness of immunization. As a vehicle we decided to use Lactobacillus strains. More than one hundred strains of Lactobacillus species isolated from chicken gut were tested. The first step was to investigate the antagonism of these bacteria against Campylobacter. Campylobacter antagonistic activity was correlated with the concentration of lactates presented in the supernatant from the culture of the tested strains. Selected strains were further tested for probiotic properties leading to five strains chosen for in vivo test. L. plantarum strains, that demonstrated the ability to reduce the level of the chicken cecum colonization by Campylobacter will be taken into account as promising carriers for antigens.Presented data extended our knowledge about Campylobacter immunogenic proteins, localization of their epitopes, and demonstrated the strategies for construction of hybrid proteins containing epitopes of several antigens. In addition they deepen the knowledge concerning using lactic acid bacteria as carriers of heterologous proteins. Insight into this complex issue will be of key importance for developing vaccines against other pathogens of poultry.