Funkcja nukleazy REXO2 w metabolizmie ludzkiego mitochondrialnego RNA

Mitochondria są półautonomicznymi organellami wewnątrzkomórkowymi, które posiadają własny genom. Ludzki genom mitochondrialny koduje jedynie 37 genów, ale każdy z nich jest niezbędny do życia człowieka.W niniejszej pracy podjęto próbę poznania funkcji ludzkiej nukleazy REXO2 w metabolizmie mitochondrialnego RNA. Zastosowano dwie główne strategie eksperymentalne: badania efektu obniżenia poziomu REXO2 w mitochondriach oraz charakterystykę biochemiczną aktywności oczyszczonego enzymu.Stwierdzono, iż REXO2 lokalizuje się w trzech różnych przedziałach komórkowych: mitochondriach, jądrze komórkowym i cytoplazmie. W związku z tym skonstruowano model komórkowy, który umożliwiał dokładne rozróżnienie pozamitochondrialnych i mitochondrialnych funkcji badanego białka.Uzyskany model został użyty do scharakteryzowania efektu deplecji REXO2 na poziom mitochondrialnych RNA. Zaobserwowano liczne zmiany: akumulowały się niekodujące transkrypty powstające na matrycy nici lekkiej mtDNA i kilkukrotnie wzrastał poziom dwuniciowego RNA w mitochondriach. Szczególnie silny efekt zaobserwowano w przypadku 16-nukleotydowego RNA nazwanego ncH2. Fenotyp ten był specyficzny dla wyciszenia REXO2 i nie był zależny od funkcjonowania degradosomu.W trakcie prowadzonych eksperymentów in vitro udowodniono, iż REXO2 tworzy homodimery i może degradować nie tylko nanoRNA (cząsteczki RNA ≤5 nukleotydów), ale również znacznie dłuższe RNA i DNA. Profil degradacji krótkich i dłuższych cząsteczek różnił się znacząco, sugerując, iż nanoRNA są degradowane w sposób procesywny, a dłuższe fragmenty RNA – dystrybutywny. Ponadto wykryto specyficzność sekwencyjną enzymu, który szczególnie wydajnie trawił ciągi urydylowe, natomiast cząsteczki poliadenylowane były degradowane znacznie wolniej. REXO2 nie było aktywne wobec dwuniciowych i ustrukturyzowanych substratów RNA, więc za obserwowaną in vivo akumulację takich cząsteczek musi odpowiadać pośredni mechanizm, prawdopodobnie zależny od degradosomu mitochondrialnego. Wskazują na to wyniki przeprowadzonych eksperymentów z wykorzystaniem oczyszczonych podjednostek degradosomu, które sugerują, iż usuwanie przez REXO2 cząsteczek nanoRNA zwiększa wydajność trawienia dłuższych substratów przez degradosom.Podsumowując, w ramach niniejszej rozprawy potwierdzono, że REXO2 jest mitochondrialnym białkiem o aktywności oligorybonukleazy, które pełni bardzo istotną funkcji w metabolizmie mtRNA. Jak wskazują uzyskane wyniki, prawdopodobnie składa się na nią zarówno degradacja do mononukleotydów cząsteczek nanoRNA generowanych przez degradosom, jak również usuwanie krótkich RNA powstających w wyniku obróbki mitochondrialnych policistronowych transkryptów.

Mitochondria are semiautonomous subcellular organelles which contain their own genome. Human mitochondrial genome codes only 37 genes, but every mtDNA-coded gene is essential.The aim of this thesis was to elucidate the function of human nuclease REXO2 in the mitochondrial RNA metabolism. Two main experimental strategies were employed: study of mitochondrial phenotype of REXO2 depletion and biochemical characterization of purified enzyme.REXO2 was found to localize in three distinct cellular compartments: mitochondria, cell nucleus and cytoplasm. Thus, a cellular model allowing to dissect mitochondrial and non-mitochondrial REXO2 functions was constructed.The cellular model was used to characterize the effect of REXO2 knockdown on mitochondrial RNA level. Several changes were observed, like accumulation of non-coding RNA species originating from transcription mtDNA light strand and increase of mitochondrial double-stranded RNA level. Especially strong effect was detected in case of short (16 nucleotides) transcript named ncH2. This phenotype was specific for REXO2 depletion and did not depend on mitochondrial degradosome activity.The experiments performed in vitro allowed to determine that REXO2 exists as homodimer and is active not only towards nanoRNA (RNA molecules ≤5 nucleotides long), but also towards significantly longer RNA species. Degradation profiles of short and long RNAs was different, what suggests that REXO2 processively degrades nanoRNAs, while longer species are degraded distributively. REXO2 was also found to possess sequence specificity: uridine-rich substrates were preferred, while polyadenylated RNAs were degraded in much less efficient way. REXO2 was not active towards double-stranded or structured RNA substrates. Hence, accumulation of such RNA species observed in vivo upon REXO2 silencing has to cause by an indirect, probably degradosome-dependent mechanism. Such conclusion was supported by in vitro experiments which showed that turnover of nanoRNAs by REXO2 might increase efficiency of degradation of longer RNA substrates by the mitochondrial degradosome.In conclusion, the presented doctoral thesis proves that REXO2 is a mitochondrial oligoribonuclease constituting a crucial element of mitochondrial RNA metabolism. Obtained results suggest that REXO2 is involved in degradation of nanoRNAs left by the mitochondrial degradosome as well as of short RNA species generated by processing ofmitochondrial polycistronic transcripts.