Triazolopeptydowe inhibitory kompleksu VEGF165/NRP-1

Neuropilina-1 (NRP-1) jest białkiem eksprymowanym przez szereg typów komórek somatycznych. Co więcej, wykazano jego nadekspresję w kilku rodzajach nowotworów złośliwych, np.: rak piersi. Uważa się również, że w patologicznej angiogenezie oddziaływanie NRP-1 z czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF165) prowadzi do unaczynienia nowotworu i jego wzrost. Dodatkowo, ten kompleks sygnałowy jest także zaangażowany w wyciszanie odpowiedzi immunologicznej przeciwko nowotworowi. Dlatego też inhibitory kompleksu VEGF165/NRP-1 są bardzo interesującymi związkami posiadającymi właściwości blokowania kilku szlaków regulacji wzrostu nowotworu i tworzenia przerzutów. W ramach poprzednich projektów (Pracownia Peptydów) skupiono się na zaprojektowaniu silnych inhibitorów tworzenia się tego kompleksu o ogólnej sekwencji H-Lys(Har)-Xaa-Xaa-Arg-OH. Związki wiodące zostały zbadane we wstępnych testach mierzących odporność na proteolizę w ludzkim osoczu, w ramach których stwierdzono, że hydroliza zachodzi w obszarze łącznika (-Xaa-Xaa-). Głównym celem niniejszej pracy było zaprojektowanie i synteza takiego elementu strukturalnego, który będzie stabilny proteolitycznie. Do osiągnięcia tego wybrano 1,4-dipodstawione 1,2,3-triazole, a badania podzielono na kilka etapów. W pierwszym etapie zostały zaprojektowane dwie podgrupy triazolopeptydów podstawiane odpowiednio: 1) w obszarze łącznika cząsteczki: -Xaa-Xaa- 2) w obszarze ramienia cząsteczki: H-Lys(Har)-. W drugim etapie opracowano protokół syntetyczny otrzymywania triazolopeptydów na fazie stałej, który może być prowadzony na klasycznych żywicach polistyrenowych z linkerem Wanga. Pozwala to na uniknięcie konieczności prowadzenia syntezy w roztworze, która jest bardziej czasochłonna niż synteza na fazie stałej. Wszystkie reakcje na stałym podłożu zachodzą ilościowo i pozwalają otrzymać triazolopeptydy w 10-14 etapach z wydajnością sumaryczną ok. 20% po oczyszczaniu techniką HPLC. W trzecim etapie przeprowadzono badania aktywności inhibicyjnej na tworzenie się kompleksu VEGF165/NRP-1. Testy przeprowadzono przy użyciu techniki immunoenzymatycznej ELISA. Uzyskane wyniki wskazały, że aktywność inhibicyjna w stężeniu 10 μM waha się w przedziale 9,2-58,1%. W czwartym etapie wykorzystano technikę dynamiki molekularnej na superkomputerze ICM do wymodelowania oddziaływań między NRP-1 a triazolopeptydami. Wybrano reprezentacyjne ułożenie liganda, które może być wykorzystane do wyjaśnienia trendów zmierzonych w teście ELISA.W piątym etapie dokonano połączenia wyników z dwóch poprzednich. Wywnioskowano, ze triazolopeptydy wykazują słabszą aktywność ale najlepsze z nich cechują się podobną aktywnością co heptapeptyd A7R, którego działanie zostało sprawdzone w modelach zwierzęcych. W szóstym etapie przeprowadzono badania odporności na degradację proteolityczną najsilniejszych triazolopeptydów w ludzkim osoczu z zastosowaniem techniki HPLC-MS. Wyniki wskazują, że pierścienie triazolowe są kompletnie stabilne a czas półtrwania związków przekracza 48 godzin. Należy wziąć również pod uwagę fakt, że wydłużona ekspozycja komórek na działanie związków chemicznych może nieść pewien efekt toksyczny. Z tego powodu zdrowe komórki pochodzące ze szpiku kostnego (linia mysia 32D) zostały poddane inkubacji w 100 μM roztworze triazolopeptydu 4 przez 48 godzin i po tym eksperymencie nie zaobserwowano śmierci tych komórek. Podsumowując, triazolopeptydy można otrzymać w łatwy sposób dzięki opracowanemu protokołowi syntetycznemu na fazie stałej. Udokumentowano aktywność inhibicyjną zaprojektowanych triazolopeptydów na tworzenie się kompleksu VEGF165/NRR-1, a najlepsze analogi charakteryzują się podobną siłą działania co A7R. Co więcej, odporność na proteolizę otrzymanych triazolopeptydów jest znacznie większa niż związku wyjściowego. Wszystkie uzyskane wyniki sugerują, że ta klasa związków może łączyć w sobie aktywność tego typu peptydomimetyków oraz odporność proteolityczną charakterystyczną dla związków małocząsteczkowych.

Neuropilin-1 (NRP-1) is a protein expressed by a number of types of somatic cells. Moreover, it has been found to be overexpressed in several kinds of malignant tumors e.g. breast cancer and it is postulated that in pathological angiogenesis its interaction with the Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF165) leads to progression of tumor vascularization and growth. Additionally, this signaling complex is also involved in suppression of immune response against tumor cells. Inhibitors of the VEGF165/NRP-1 complex are very attractive compounds to block several processes regulating tumor growth and metastasis. In the frame of previous projects (Laboratory of Peptides) efforts have been made to design strong inhibitors of this interaction with general sequence H-Lys(Har)-Xaa-Xaa-Arg-OH. Lead compounds were tested in a preliminary assay toward proteolytic stability in human serum. It has been observed that proteolysis occurs in the linker site of the molecule (-Xaa-Xaa-). The main aim of this dissertation is to desing and synthesize mimetics of such structural element with the proteolytically resistant one. For this purpose a 1,4-disubstituted 1,2,3-triazole was chosen. To achieve this goal all presented research was devided in several stages. In the first stage two subseries of triazolopeptides were designed with major modifications in: 1) the linker site of the molecule: -Xaa-Xaa- 2) the arm site of the molecule: H-Lys(Har)- The second stage was to elaborate the synthetic protocol for triazolopeptide synthesis on solid support, which could be proceeded on traditional polystyrene resins with Wang linker. It allows to avoid synthesis in liquid phase, which is more time consuming related to solid phase approach. All reactions on solid support proceed quantitatively affording designed peptidotriazoles in 10-14 synthetic steps and final yield c.a 20% after HPLC purification. The third stage of this work was to study the inhibitory activity toward VEGF165 binding to NRP-1. This was achieved by immonoenzymatic assay ELISA. In the frame of x this step, it was observed, that inhibitory activity spans from 9.2% to 58.1% at concentration of 10 μM. The fourth stage was to model the interaction with supercomputer OKEANOS ICM using molecular dynamics approach. The representative binding pose was proposed, which could be used for explanation of observed trends in ELISA test. The fifth stage was to combine the results from two previous ones. It was concluded, that peptidotriazoles are in general weaker than the lead compound, however the best of them exhibit inhibitory activity on similar level in comparison with A7R heptapeptide, which activity was validated in in vivo model. The sixth stage of this dissertation was planned to study proteolytic resistance of the best triazolopeptides in human plasma with the use of HPLC-MS technique. The analysis showed that this triazole rings are completely stable under proteolytic environment and the half-life exceed 48h. It should be considered, that prolonged exposition for chemicals could be related with some toxic effects on normal cells. For this reason, normal, healthy bone marrow cells 32D (murine) were subjected to incubation in 100 μM solution of triazolopeptide 4 for 48h and no cells death was observed. In summary, triazolopeptides could be easily prepared with the use of elaborated synthetic protocol on solid support. It was proved, that those compounds exhibit inhibitory activity toward VEGF165 binding to NRP-1 and the best compounds exhibit similar level of activity in in vitro comparison to A7R. Moreover, proteolytic stability of triazolopeptides is considerably higher than the lead compound. All these findings suggest, that this class of compounds is able to link activity of such peptidomimetics and proteolytic resistance of small molecules, and might be a perspective in this field for the future.