Wybrane mechanizmy modulujące ekspresję czynnika transkrypcyjnego HIF-1 w kanalikach proksymalnych nerek oraz jego rola w regulacji aktywności nerkowej glukoneogenezy

Czynnik transkrypcyjny indukowany hipoksją 1 (ang. hypoxia inducible factor 1; HIF-1) jest głównym mediatorem odpowiedzi metabolicznej na stan hipoksji w kanalikach proksymalnych nerek. Rozprawa doktorska mgr Aleksandry Owczarek została poświęcona zależnościom łączącym HIF-1 z metabolizmem glukozy w nerkach, w tym wpływowi hiperglikemii na aktywność tego czynnika oraz roli HIF-1 w regulacji nerkowej glukoneogenezy (syntezy glukozy de novo z substratów niecukrowych). Ponadto autorkę interesował wpływ melatoniny, znanej z działania nefroprotekcyjnego (m.in. w przebiegu nefropatii cukrzycowych), na ekspresję podjednostki regulatorowej czynnika – HIF-1α. Celem badań, których wyniki zostały przedstawione w dwóch opublikowanych pracach oraz maszynopisie przygotowanym do zgłoszenia do publikacji, była weryfikacja trzech hipotez: 1) podwyższona aktywność HIF-1, poprzez bezpośredni wpływ na transkrypcję genów kodujących enzymy glukoneogenezy, może zwiększać wytwarzanie glukozy de novo w nerkach [Biochimie 2020;171-172:31-37]; 2) melatonina może obniżać ekspresję lub/i stabilność czynnika HIF-1 w komórkach HK-2, a mechanizm tego zjawiska może dotyczyć zmian aktywności sirtuin i poziomu acetylacji podjednostki HIF-1α [Front Physiol 2021; 11:572911]; 3) w obecności wysokiego stężenia glukozy w komórkach HK-2 może dochodzić do wzrostu ekspresji HIF-1α, za co mogą być odpowiedzialne mechanizmy działające na poziomie transkrypcji (np. aktywacja czynnika transkrypcyjnego ChREBP) lub/i na poziomie stabilności białka (np. zmiany aktywności sirtuin i poziomu acetylacji HIF-1α) [maszynopis 1]. W swoich badaniach mgr Aleksandra Owczarek wykorzystała komórki HK-2 (unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonkowe proksymalnych kanalików nerkowych), a także – w [maszynopis 1] – pierwotne komórki epitelialne proksymalnych kanalików nerkowych pochodzące od osoby zdrowej (RPTEC) oraz od pacjenta z cukrzycą typu 2 (D-RPTEC). Komórki były hodowane w warunkach normoksji lub hipoksji (1% tlenu). Wśród zastosowanych przez autorkę metod znalazły się m.in.: Western blot, immunoprecypitacja białkowa, immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), RT-qPCR, wyciszanie genów z zastosowaniem siRNA oraz wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (HPLC-MS).

Hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) is the main mediator of metabolic response to hypoxia in renal proximal tubules. Aleksandra Owczarek’s Ph.D. thesis is focused on the relationships linking HIF-1 with renal glucose metabolism, including hyperglycaemia effect on its activity and HIF-1 importance in the regulation of renal gluconeogenesis (glucose synthesis de novo from non-sugar precursors). Moreover, the author was interested in the influence of melatonin, known for its nephroprotective action (e.g. in diabetic nephropathy), on the expression of the regulatory subunit – HIF-1α. The aim of the research, results of which are presented in two already published papers and one typescript prepared for the submission, was the verification of the following hypotheses: 1) increased activity of HIF-1, by a direct effect on the transcription of genes encoding enzymes of gluconeogenesis, may augment glucose synthesis de novo in kidneys [Biochimie 2020;171-172:31-37]; 2) melatonin may decrease the expression and/or stability of HIF-1α in HK-2 cells and the mechanism of this phenomenon could be related to the changes in sirtuin activity and in HIF-1α acetylation level [Front Physiol 2021; 11:572911]; 3) high glucose conditions may lead to the increased expression of HIF-1α in HK-2 cells; this phenomenon may result from transcriptional mechanisms (e.g. activation of transcription factor ChREBP) and/or mechanisms stabilizing the already existing protein (e.g. increased acetylation of HIF-1α caused by diminished activity of caused by diminished activity of sirtuins) [typescript 1]. I her study Aleksandra Owczarek used HK-2 cells (immortalized human epithelial cells of renal proximal tubules) and also – in [typescript 1] – primary epithelial cells of renal proximal tubules withdrawn from a healthy person (RPTEC) and from a patient with type 2 diabetes (D-RPTEC). The cells were cultured under normoxic and hypoxic (1% oxygen) conditions. The applied methods included: Western blot, protein immunoprecipitation, chromatin immunoprecipitation (ChIP), RT-qPCR, gene silencing with siRNA and high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (HPLC-MS). M.Sc.