Positioning of substrates for the first step of splicing catalysis

Prawidłowe umiejscowienie substratów do katalizy jest kluczowe dla precyzyjnego splicingu pre-mRNA. Spliceosom musi prawidłowo rozpoznać i umiejscowić miejsca splicingowe w centrum katalitycznym. Zadanie to staje się jeszcze bardziej złożone, gdyż reakcja splicingu składa się z dwóch odrębnych etapów katalitycznych, a substrat musi się przemieścić pomiędzy tymi etapami. Cały proces jest koordynowany przez interakcje RNA:RNA oraz RNA:białko w miejscach splicingowych, jak również dodatkowe interakcje między czynnikami spliceosomu a innymi regionami pre-mRNA. W moich badaniach zidentyfikowałam dwie klasy motywów w 5′ egzonach: motyw bogaty w reszty A (A-rich), który wzmacnia rozpoznanie miejsca splicingowego 5′ (5′SS) na wczesnych etapach formowania spliceosomu, oraz motyw bogaty w reszty C (C-rich), który stabilizuje umiejscowienie 5′SS w pierwszym etapie katalitycznym. Co ciekawe, motyw C-rich promuje pierwszy etap splicingu, jednocześnie utrudniając przejście do drugiego etapu, co sugeruje, że pewne interakcje wokół 5′ egzonu muszą zostać zdestabilizowane pomiędzy dwoma etapami katalizy. Skumulowane efekty wielokrotnego rozpoznania motywów w 5′ egzonie przez różne czynniki spliceosomu podkreślają znaczenie tych motywów w prawidłowym umiejscowieniu 5′SS do katalizy. Dodatkowo badałam interakcje z udziałem czynników splicingowych Cwc2, U6 snRNA oraz N-końcowej domeny białka Prp8, pokazując, że te czynniki stabilizują konformację katalityczną pierwszego etapu. Allele w obrębie Cwc2, U6 i Prp8 zaburzają te stabilizujące interakcje, ułatwiając przejście do drugiego etapu katalitycznego. Allele w regionie N-końcowym białka Prp8 wpływają również na drugi etap katalizy, destabilizując kluczowe interakcje w centrum katalitycznym. Zrozumienie tych interakcji dostarcza wglądu w dynamiczne zmiany zachodzące w centrum katalitycznym spliceosomu w trakcie cyklu splicingu.

Proper substrate positioning for catalysis is critical for accurate pre-mRNA splicing. The spliceosome must recognize and correctly place splice sites at its catalytic center. The task becomes even more complex as splicing requires two distinct catalytic steps, with the substrate needing to reposition between them. This process is mediated by RNA:RNA and RNA:protein interactions at splice sites and additional contacts between spliceosomal factors with regions of pre-mRNA outside core splicing signals. In my research, I identified two classes of 5′ exon motifs: the A-rich motif, which enhances early-stage 5′SS recognition, and the C-rich motif, which stabilizes 5′SS positioning for the first catalytic step. Interestingly, whereas the C-motif promotes the first splicing step, it hinders the transition to the second step, suggesting that 5′ exon interactions must be disrupted between catalytic steps. The cumulative effects of multiple recognition events by various spliceosomal factors underscore the importance of these motifs in 5′SS positioning. Additionally, I investigated interactions involving Cwc2, U6 snRNA, and the N-terminal region of Prp8, showing that these factors stabilize the first-step catalytic conformation. Alleles within Cwc2, U6, and Prp8 disrupt these stabilizing interactions, facilitating the transition to the second step catalytic state. Prp8 N-terminal alleles also influence the second catalytic step by destabilizing key interactions within the catalytic center. Understanding these interactions provides insight into the dynamic rearrangements occurring at the spliceosomal catalytic center during the splicing cycle.