Scenariusz analityczny badania specjacji cynku w tkankach roślin hałdowych

W części eksperymentalnej opisano metodę określania całkowitej zawartości cynku w materiale roślinnym, wraz z elementami jej walidacji. Położono nacisk na wybór odpowiedniego izotopu, optymalizację pracy spektrometru, sposobu przygotowania próbek i ich mineralizacji. Dużo miejsca poświęcono ekstrakcji związków cynku z tkanki roślinnej do roztworu. Podkreślano, że jest to krok w wielu aspektach decydujący o sukcesie badań specjacji: zarówno pod kątem ilościowym, jak i jakościowym. Do ekstrakcji związków cynku użyto roztworów buforowych w szerokim zakresie pH (od 4,1 do 10,0), co pozwoliło na zbadanie wpływ pH ekstrahenta na specjację cynku i na ogólną wydajność ekstrakcji. Ekstrakcję prowadzono z materiału poddawanego wcześniej homogenizacji ciekłym azotem w celu zniszczenia ścian komórkowych i ułatwienia dostępu ekstrahenta do poszczególnych organelli komórkowych. Drugim z zaproponowanych sposobów była ekstrakcja CO2 w stanie nadkytycznym, metoda mająca wiele zalet, z punktu widzenia analizy specjacyjnej. Ważnym aspektem pracy było porównanie ekstrakcji po homogenizacji ciekłym azotem i ekstrakcji z zastosowaniem CO2 w stanie nadkrytycznym pod względem krytycznych z punktu widzenia analizy specjacyjnej parametrów, takich jak: ogólna wydajność ekstrakcji, stężenie związków cynku w ekstrakcie, czy specjacja cynku. Następnie przedstawiono scenariusz analityczny umożliwiający oznaczanie cynku i jego związków w tkankach rośliny Plantago. Zastosowano dwa mechanizmy rozdzielania w układzie wysokosprawnej chromatografii cieczowa: I - chromatografia wykluczenia (SEC); II - chromatografia kationowymienna (IC). W obu układach rejestrowano sygnały z użyciem spektrometru mas z jonizacją w plazmie sprzężonej indukcyjnie. Oba rodzaje chromatografii stosowano zamiennie, co pozwoliło na: określenie mas cząsteczkowych związków cynku, określenie polarności związków cynku i ostatecznie przypisanie sygnałów do konkretnych składników poszczególnych frakcji. Przedstawiono również możliwość wykorzystania chromatografii anionowymiennej w pierwszym wymiarze. Podejście to umożliwiło obserwacę dodatkowych sygnałów, od związków których nie udało się rozdzielić w przypadku zastosowania w pierwszym wymiarze chromatografii kationowymiennej. 123 W efekcie możliwa była obserwacja wpływu pH ekstrahenta na całkowitą wydajność ekstrakcji (procedura określania całkowitej zawartości) i specjację cynku (2D HPLC ICP MS). Zauważono, że wraz ze wzrostem pH ekstrahenta rośnie różnorodność specjacyjna form cynku, ale maleje ogólna wydajność ekstrakcji. Zaobserwowano, że tylko ekstrahenty o pH 7,4 i 10,0 pozwoliły na rejestrację sygnałów od wielkocząsteczkowej frakcji cynku (HMW). Zastosowanie ekstrakcji CO2 w stanie nadkrytycznym umożliwia otrzymanie ekstraktów o bardzo wysokim stężeniu poszczególnych form cynku, co wynika z bardzo korzystnego (wysokiego) stosunku masy próbki roślinnej do ostatecznej masy ekstraktu. Wydajność ekstrakcji z zastosowaniem CO2 w stanie nadkrytycznym jest natomiast porównywalna do tej otrzymanej dla ekstrakcji po homogenizacji z ciekłym azotem. Następnie opisano zastosowanie opracowanego scenariusza analitycznego do porównania pod kątem specjacji cynku dwóch populacji rośliny Plantago. Porównano również specjację Zn w podziemnych i nadziemnych częściach roślin obu populacji.